冯立玲，胥文玲，罗军昆，王清华，白晓玲

蒙牛乳业（滦南）有限责任公司，河北唐山 063500

0 引言

超高温灭菌乳的保质期时间较长，在储存过程会存在多种质量缺陷，如脂肪上浮、结块、酸包、胀包等问题。其中脂肪上浮现象一直是影响长货架期超高温灭菌乳等乳制品质量的首要问题。不同程度的脂肪上浮现象均影响产品的外观及品质，严重时在包装顶部可形成几毫米厚的脂肪层，给消费者食用时带来不愉悦的感受和体验。降低或减少脂肪上浮现象，成为乳品企业改善产品品质的重要环节。

牛奶中的脂肪以小液滴形式存在，称为乳脂肪球[1]。牛奶中的脂肪球由于粒度大小不等、密度小、质量轻而浮在牛奶表面形成一层奶油层，使牛奶产生分层现象[2]，因此需要进行均质化处理。均质化处理给牛奶带来许多优点，如脂肪球变小，不形成奶油层；颜色更白、口感更佳；降低脂肪氧化敏感性，具有更强稳定性和更长保质期[3～5]，成为了现代乳制品生产中不可或缺的工艺[6]。

为监控均质化效果，对均质化过程中牛奶脂肪球粒度的测定十分必要。激光粒度法作为一种快速、准确的粒度测试方法已被应用，但激光粒度分析仪较贵，检测成本较高，一般乳品企业无法承担[7]。为促进生产过程均质效果改善，同时提升产品稳定性，需研发一种低成本、高效率、快速检测脂肪球粒径大小的方法。本文通过试验论述脂肪球粒径检测方法的研发过程，对比不同染色剂染色脂肪球的现象差异，从而确定出最优方案。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

苏丹Ⅲ，福晨（天津）化学试剂有限公司；甲基红、次甲基蓝、铬黑T、溴甲酚绿、甲基橙、95%浓度乙醇、草酸铵，福晨（天津）化学试剂有限公司；结晶紫、番红，北京陆桥技术股份有限公司。

ME2002E/02电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；RX50显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；玻璃烧杯；载玻片；盖玻片；滴管；镊子。

1.2 染色剂选择

苏丹Ⅲ是一种常用的脂肪类染液，遇脂肪会变为橘黄色。甲基橙是分析化学中常用酸碱指示剂，在中性介质中以磺酸钠盐形式存在而呈现黄色，超高温灭菌乳通常为中性样品，可制备甲基橙指示剂用于该试验。另外，甲基红指示剂、次甲基蓝指示剂、铬黑T指示剂、溴甲酚绿指示剂、结晶紫指示剂、番红指示剂均为实验室日常检测常用指示剂，本文引入这些指示剂用来进行试验，对比染色效果。

1.3 试剂配制

苏丹Ⅲ指示剂：称取0.25 g苏丹Ⅲ粉末于锥形瓶中，加入95%浓度酒精50 mL，充分搅拌混合均匀，过滤后备用。

甲基红指示剂：称取0.1 g甲基红，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

次甲基蓝指示剂：称取0.1 g亚甲基蓝，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

铬黑T指示剂：称取0.5 g铬黑T，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

溴甲酚绿指示剂：称取0.1 g溴甲酚绿，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

甲基橙指示剂：称取0.1 g甲基橙，溶于70 ℃水中，冷却，稀释至100 mL。

结晶紫指示剂：称取0.1 g甲基红，用20 mL 95%乙醇溶解；称取草酸铵0.8 g，用80 mL实验用水溶解；使用前将上述两种溶液混合过滤后备用。

番红指示剂：称取2.5 g甲基红，用95%乙醇溶解并定容至100 mL。使用前取10 mL已配制的溶液，加入90 mL实验用水混匀后备用。

1.4 染色方法

待测样品与染色剂混匀后直接检测，无需其他处理。另外，为降低试验操作过程中使用酒精灯存在的安全风险，减少常规制片过程使用酒精灯烘干的操作步骤，借鉴生物检验花生中的脂肪实验操作步骤[8]中染色制片方法。除苏丹Ⅲ染色法外，本文通过使用盖玻片，验证液体样品不烘干也能实现固定的目的。

1.4.1 苏丹Ⅲ染色法

参考《牛奶脂肪球观测方法》[9]，具体操作步骤如下。

（1）制片：取若干滴牛奶置于载玻片上，用镊子固定玻片一端置于酒精灯火焰上方，直至牛奶滴烘干。

（2）染色：在烘干后的牛奶滴上滴加苏丹Ⅲ指示剂，静置染色1～2 min，然后用镊子夹住载玻片一端置于酒精灯火焰上方，直至苏丹Ⅲ指示剂烘干。

（3）观察：将载玻片置于显微镜下，选取放大倍数为10 倍的物镜，在100 倍（10×10）条件下，观察染色后牛奶滴中的脂肪球。

1.4.2 甲基橙染色法

（1）制片染色：取1 滴已混合均匀的牛奶样品置于载玻片上，在滴加牛奶样品的位置滴加1 滴甲基橙指示剂，再将一片盖玻片用镊子轻轻覆盖在上面。

（2）分析观察：将步骤（1）制备好的样品置于显微镜下，在100 倍（10×10）条件下观察。可直接用目镜，也可用显微镜软件进行观察。

（3）结果判定 ：将载玻片置于显微镜下，选取放大倍数为10 倍的物镜，在100 倍（10×10）条件下，观察染色后牛奶滴中的脂肪球，也可以利用显微镜操作软件，通过软件参数设置，更直接、更清晰观察脂肪球形态，还可测量脂肪球粒径大小。

1.4.3 其他染色剂法

将结晶紫、番红、甲基红、溴甲酚绿、次甲基蓝、铬黑T指示剂，依据1.4.2步骤操作。

1.5 结果判定

镜检观察：未经均质处理或均质效果差的样品，脂肪球大小不均匀，外形不规则，形态较大。经均质处理后的样品，脂肪球为大小均匀的球形颗粒，形态较小。

本文试验要求镜检观察的结果为脂肪球外形清晰可见，粒径大小可通过测量确定具体数值。

2 结果与分析

2.1 试验结果

2.1.1 不同染色剂对比

针对试验使用的8 种染色剂，在操作便捷性、观察难易性、染色均匀程度及背景清晰程度等方面进行比较（表1）。甲基橙染色法较其他方法优势更明显。

表1 不同染色方法操作对比

2.1.2 染色剂与样品的适宜性

抽取超高温灭菌乳和调制乳各10 批，分别用8种染色剂进行样品适宜性验证（表2）。

表2 不同染色方法样品适宜性对比

适宜性评价标准：染色剂与样品充分融合，染色均匀，镜检观察时无背景杂质干扰。

除甲基橙外，其他染色剂与样品混合的过程中均存在不能充分融合的现象，镜检时视野下背景干扰影响观察效果，故甲基橙染色法较其他方法优势更明显。

2.1.3 不同染色剂染色图片

用显微镜观察8 种不同染色剂对同一超高温灭菌乳进行脂肪球染色，各种染色剂染色效果存在差异，其中甲基橙染色效果最好，背景最清晰，染色后的脂肪球更易观察；相比而言，其他染色剂染色效果较差，染色后的脂肪球不易观察（图1）。

图1 不同染色剂染色图片

2.2 分析方法评价

2.2.1 苏丹Ⅲ染色法

苏丹Ⅲ染色法为已有参考文献可查询的一种脂肪球检测方法，在试验中发现存在4 处缺陷，具体如下。

（1）试剂配制：苏丹Ⅲ染液配制过程存在溶解不充分现象，需过滤操作，步骤繁琐。

（2）制片：由于需观测样品为液体，具有流动性，依据染色操作要求，为便于观察，该方法对液体样品通过烘干操作进行固定。执行该步骤需使用酒精灯，由于牛奶营养物质丰富，经烘干操作后，部分有机物由于烘烤温度过高或时间过长容易糊化，染色后背景杂质较多，导致脂肪球不易观察，干扰实验人员操作，因此烘干环节需优化或取消。另外，酒精灯存在火灾风险。

（3）烘干：酒精纯度越高，燃烧越充分，燃点越旺盛。该方法使用浓度为95%乙醇配制染色液，染色后烘干操作，载玻片经过酒精灯火焰时，极易引起燃烧，危险性较大。

（4）染色：该步骤需静置后再次使用酒精灯烘干，耗时较长。

2.2.2 甲基橙染色法

该方法操作简便、快捷高效，具体优势如下。

（1）取1 滴混匀后的样品即可满足实验要求，不需烘干操作，立即滴加染色液，可实现染色均匀目的。

（2）染色后无需静置，增加盖玻片使用。盖玻片的作用：可使被观察物形成薄膜，易透光，便于观察；可使标本相对固定；便于利用毛细现象，使染色液形成梯度，脂肪球染色更充分；避免标本受污染。

2.2.3 其他染色剂法

结晶紫、番红、甲基红、溴甲酚绿、次甲基蓝、铬黑T指示剂滴加至牛奶样品后，指示剂和牛奶样品都不能有效融合，产生肉眼可见颗粒物质，镜检时会发现染色效果差，背景干扰杂质多，影响观察效果。

3 结论与讨论

为降低超高温灭菌乳货架期内脂肪上浮现象，在牛奶均质化及产品稳定性研究过程中，对脂肪球粒径进行监控十分必要。在注重产品质量同时，考虑检测效率成本等因素，乳品企业尤其需高效率、低成本、快速检测脂肪球粒径的方法。

本文对实验室日常使用指示剂进行设计，在超高温灭菌乳中开展脂肪球检测试验对比，最终确定甲基橙染色法为最优方法。传统显微镜直接观察方式，只能获得脂肪球大小的直观表象，不能了解具体粒径大小。甲基橙染色法引入显微镜操作软件，通过软件参数设置，不但可以更直接更清晰观察到脂肪球的形态，还可对脂肪球粒径大小进行测量。同时，所观察过的图片可通过软件存储，便于后期查阅。该方法快速高效，检测成本低，简便易行，操作更安全，可为均质化过程提供有效监控数据，能满足乳品企业对脂肪球粒径进行快速检测目的。