韩 敏,易 旭

(1.贵州中医药大学基础医学院,贵阳 550025;2．贵州中医药大学第二附属医院临床医学实验室,贵阳 550003)

研究表明,长期慢性酒精摄入能够通过异常酒精代谢导致的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)百分比增加、氧化应激诱导、脂质代谢紊乱、抑制自噬等机制诱发肝细胞的脂肪变性[1],从而形成酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)[2]。自噬作为各种生理和疾病条件下细胞适应和生存的一种重要机制,在维持细胞稳定性中有着重要作用[3]。研究发现,慢性酒精摄入能够激活FK-506结合蛋白(FKBP)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORc1)和抑制腺苷酸激活蛋白激酶表达,通过抑制下游的Unc-51样激酶1(ULK1)复合体形成导致自噬的抑制,出现肝细胞中脂质的积累、线粒体稳态失调和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLIP3)炎症小体活化增多等从而促进脂肪肝的形成[4-5]。因此,调节自噬是AFLD的一种潜在治疗策略,这一认识已在白藜芦醇通过增加自噬体数量,上调微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin1表达,下调p62蛋白表达发挥抗AFLD的治疗作用中得到验证[6]。研究发现,酒精暴露还可以抑制自噬激活的另一重要调节分子叉头框蛋白O1(FOXO1)的表达,导致固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)与脂肪酸合成酶表达水平上调,从而增加脂质生成和诱导肝细胞坏死[7-9]。但酒精如何介导FOXO1表达抑制仍不清楚。LIANG等[10]发现,主要在肝脏合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂B1a(SerpinB1a)表达抑制会下调FOXO1表达水平,减弱FOXO1的抗氧化应激作用,从而加重糖尿病性肾病中的氧化应激反应。这提示SerpinB1a对FOXO1表达水平的正向调控作用,但SerpinB1a是否参与AFLD的发生尚缺少文献报道。已知磷酸化信号转导和转录激活因子3(pSTAT3)可以通过对Bcl-2家族成员、自噬相关基因BECN1、磷脂酰肌醇3激酶C3(PIK3C3)等与自噬相关基因的转录调节参与自噬的抑制或活化[11]。运用乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因敲除小鼠,发现激活STAT3可以通过减弱SREBP-1c基因转录、抑制脂肪酸合成和影响脂肪肝发展来减轻乙醇摄入引起的脂肪肝[12]。此外,pSTAT3在AFLD中通过上调自噬相关基因5(ATG5)的表达促进自噬以发挥保护作用[13]。XU等[14]通过慢病毒转染抑制猪胰腺细胞SerpinB1a蛋白表达,引起pSTAT3表达水平下调,相反,过表达SerpinB1a蛋白则可以通过上调pSTAT3表达来调节细胞周期以促进猪胰腺细胞增殖,提示了SerpinB1a与pSTAT3存在正调控关系。但尚未见肝脏相关疾病中有关SerpinB1a与pSTAT3调控关系的研究报道。

基于AFLD病理阶段存在FOXO1和pSTAT3介导的肝脏自噬抑制作用及其分别与SerpinB1a的调控关系的研究认识,设想SerpinB1a在肝组织表达水平的变化可能与AFLD的发生有关。因此,本文采用4D非标记定量蛋白质组学技术鉴定、分析了SerpinB1a蛋白在AFLD小鼠肝组织中的表达水平及其在白藜芦醇抗AFLD干预机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选取雄性无特殊病原体(SPF)级C57BL/6J小鼠9只[北京唯尚立德,SCXK(京)2016-0009],体重20～24 g,在有适宜温度、湿度、光照的独立通风笼具(IVC)系统的动物房内饲养。将小鼠随机分为3组:正常对照组(C组)、模型组(M组)、白藜芦醇干预组(R组),每组各3只。

1.1.2主要试剂

95%乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);胰酶[普洛麦格(北京)生物技术有限公司];丙酮(浙江汉诺化工科技有限公司);蛋白酶抑制剂(美国Merck Millipore公司);碘乙酰胺、尿素、烟酰胺、二硫苏糖醇、三氯乙酸及四乙基溴化铵(美国Sigma公司);甲酸(美国Fluka公司);去乙酰化酶抑制剂(美国MedChemExpress公司);乙腈(美国Thermo Fisher Scientific公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);超纯水(美国Fisher Chemical公司)等。

1.2 方法

1.2.1AFLD小鼠模型建立及白藜芦醇干预

参考文献[15]方法进行AFLD模型制备,即使用江苏南通特洛菲标准型Lieber-DeCarli乙醇液体、对照液体饲料适应性喂养5 d后,自由进食10 d乙醇液体饲料,第16天灌胃给予1次95%乙醇。经鉴定模型制备成功后,按1次/d、400 mg/次灌胃给予白藜芦醇溶液(美国Sigma公司,使用灭菌的30% Kolliphor HS15溶液配制),9 d后收集肝组织标本,置于-80 ℃超低温冰箱中以备蛋白质组学检测用。

1.2.2SerpinB1a蛋白的4D非标记定量蛋白质组学分析

1.2.2.1鉴定思路

构建UniProt数据库来源的小鼠肝组织标本特异性蛋白数据库,进行标本总蛋白提取和胰酶酶解后的蛋白肽段制备,经基于高效液相色谱-质谱联用的4D非标记定量蛋白质组学技术获得并分析标本中肽段的质量与信号强度,以及肽段碎裂后碎片离子的质量和信号强度。利用Maxquant软件(v1.6.15.0)进行二级质谱数据的检索,通过算法打分过滤后获得正确匹配的理论肽段序列。

1.2.2.2肝组织中总蛋白提取、胰酶消化

称取适量小鼠肝组织样品于液氮中充分研磨成粉状并转移至5 mL的离心管。然后,加入4倍体积的组织裂解液(含50 mmol/L烟酰胺,3 μmol/L去乙酰化酶抑制剂,1%蛋白酶抑制剂及8 mol尿素)超声下裂解。在4 ℃下,12 000×g离心10 min,去除剩余碎片,收集上清液,采用BCA法测定蛋白质水平。在胰蛋白酶消化过程中,首先向离心管中加入适量标准蛋白,再加入裂解液以调整体积至一致,缓慢向其中加入20%的三氯乙酸,利用涡旋混匀仪振荡、混匀,4 ℃静置2 h以充分沉淀。4 500×g离心5 min后,用预冷的丙酮3次洗涤所得蛋白沉淀,晾干后加入200 mmol/L的四乙基溴化铵并于超声仪中充分打散,经酶底比1∶50(m/m)的胰酶消化过夜。先后加入5 mmol/L二硫苏糖醇56 ℃还原30 min、11 mmol/L碘乙酰胺室温暗孵育15 min。

1.2.2.3液相色谱-质谱联用分析

用NanoElute超高效液相系统分离溶解于液相色谱流动相A相(含2%乙腈和0.1%甲酸)中的样品蛋白肽段。配制含0.1%甲酸和100%乙腈溶液的流动相B,以0～1 min,2%～5% B;>1～76 min,>5%～27% B;>76～82 min,>27%～35% B;>82～86 min,>35%～85% B梯度,300 nL/min流速洗脱多肽。分离后的多肽被注入Capillary离子源(电压1.75 kV)中进行电离和随后的飞行时间(time-of-flight,TOF)质谱timsTOF Pro分析。采用高分辨的TOF质谱检测和分析肽段母离子及其二级碎片。参考文献[16]方法进行二级质谱扫描和数据收集。

1.2.2.4定量分析

根据质谱数据的搜库分析结果给出的每个肽段在不同样品中的信号强度信息计算蛋白的相对定量。即首先将信号强度值(I)通过中心化变化后,按公式R_{ij}=I_{ij}/Mean(I_j)得到肽段在不同样品中的相对定量值(R),i表示样品,j表示肽段;然后采用中位数归一化方法对得到的肽段相对定量值进行校正(NR)以消除不同样品在质谱检测中上样量的系统误差,计算公式:NR_{ij}=R_{ij}/Median(R_i);最后采用蛋白对应特异性肽段相对定量值的中值表示蛋白的相对定量值。计算公式:R_{ik}=Median(NR_{ij},j/in k),k表示蛋白,j表示蛋白所属的特异性肽段。分别采用Person相关性、主成分分析和相对标准差3种统计分析方法评估蛋白定量重复性。

1.2.2.5SerpinB1a蛋白基因本体论(GO)功能富集分析

采用UniProt-GOA数据库的GO分类分析方法,从分子功能、细胞组成和生物进程等角度对SerpinB1a蛋白的生物学作用进行注释,并结合当前AFLD发生机制相关国内外研究文献推测涉及AFLD发生、发展的内容。

1.2.3SerpinB1a蛋白表达的验证

1.2.3.1总体思路

采用基于质谱技术的靶向蛋白质组定量分析方法。将上述蛋白组学获得的含SerpinB1a蛋白的肽段分别进行EASY-nLC 1000超高效液相系统分离和电离后的Q-ExactiveTMPlus质谱分析,经Max-Quant软件(v1.6.15.0)数据库搜索后进行数据处理。

1.2.3.2液相色谱-质谱联用分析

SerpinB1a蛋白肽段来自上述蛋白组学剩余肽段,经液相色谱流动相A相(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解后,使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度设置:0～16 min,7%～25% B;>16～22 min,>25%～35% B;>22～26 min,>35%～80% B;>26～30 min,>80% B,流速维持在500 nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入纳米喷雾电离(NSI)离子源中进行电离,然后用Q ExactiveTMPlus质谱进行分析。离子源电压设置为2.1 kV,肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为360～1 020 m/z,扫描分辨率设置为70 000;二级质谱Orbitrap扫描分辨率设置为17 500。数据采集模式使用数据非依赖型扫描(DIA)程序,高能碰撞离解(HCD)碰撞池的碎裂能量设置为27。一级质谱自动增益控制(AGC)设置为3E6,最大离子注入时间(maximum IT)设置为50 ms;二级质谱AGC设置为1E5,maximum IT设置为250 ms,隔离窗口设置为1.6 m/z。

1.2.3.3数据处理

肽段参数设置:蛋白酶为胰蛋白酶[KR/P],K、R、P分别代表赖氨酸、精氨酸、脯氨酸,最大漏切位点数为0,肽段长度为7～25个氨基酸残基,设置半胱氨酸烷基化为固定修饰。Transition参数设置:母离子电荷为2,3;子离子电荷为1;离子类型为b,y。碎片离子选择从第3个开始至最后1个,并设置离子匹配的质量误差容忍度为0.02 Da。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 SerpinB1a蛋白的4D非标记定量蛋白质组学鉴定与定量结果

经课题组前期造模成功后,在蛋白组学中各实验组肝组织中均鉴定到SerpinB1a蛋白,蛋白质登记号:Q9D154,肽段:FQSLNAEVSK。以3组中SerpinB1a蛋白质重复测量平均值比值作为差异倍数,当P≤0.05且差异倍数≥2或≤0.5时被认为具有明显差异。与C组(2.18±0.51)比较,M组SerpinB1a蛋白相对表达水平(0.18±0.09)明显下降(P=0.002),下调表达0.08倍;与M组比较,R组SerpinB1a蛋白相对表达水平(1.08±0.07)明显升高(P=0.004),上调表达6.00倍。

2.2 SerpinB1a蛋白的GO富集分析结果

经GO富集分析,显示SerpinB1a蛋白共涉及8个分子功能、20个细胞组成和59个生物进程,进一步推测其中的2个分子功能、3个细胞组成和12个生物进程涉及AFLD的发生、发展,见表1。

表1 SerpinB1a蛋白的GO富集分析

2.3 SerpinB1a蛋白表达的验证

利用以质谱技术为基础的靶向蛋白质组定量技术对SerpinB1a蛋白表达水平进行验证。采用峰面积进行定量,呈现的7种颜色条带分别对应肽段在质谱仪中裂解后的7种特异性氨基酸序列,见图1。结果显示:与C组比较,M组SerpinB1a蛋白表达水平下调0.21倍,与上述4D非标记定量蛋白质组学的定量结果一致。

C1～C3:C组;M1～M3:M组。

3 讨 论

近年来,日益发展的蛋白质组学技术在基因组学等其他“组学”技术基础上进一步表明了生物个体蛋白的身份、识别蛋白质的分子构成,为探究疾病的发病机制、寻找分子标志物和了解药物作用靶点等提供了重要线索[17-18]。运用蛋白组学方法在非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型和相应的临床患者肝脏中均发现自噬相关基因3(ATG3)是与脂肪变性发生有关的新分子,其表达与NAFLD脂肪变性分级和活动评分呈正相关[19]。CARLSSON等[20]运用蛋白质组学方法发现,生长分化因子15是糖尿病肾病和心血管事件发生的潜在生物标志物,为糖尿病肾病和心血管疾病的机制研究提供了新的见解。DING等[21]运用等压标记定量蛋白质组学技术,发现超氧化物歧化酶2(SOD2)在唾液中可能作为肝细胞癌的潜在生物标记物,提供了一种无创、廉价的唾液检测方法来检测肝细胞癌。本研究借助蛋白质组学技术的优势,采用4D非标记定量蛋白质组学技术检测和分析了乙醇喂养AFLD小鼠和经白藜芦醇干预后的小鼠肝组织SerpinB1a蛋白表达水平变化。结果显示,M组小鼠肝组织SerpinB1a蛋白表达水平较C组下调0.08倍,经白藜芦醇干预后上调6.00倍。表明慢性酒精摄入可以引起肝组织SerpinB1a蛋白表达水平下降,提示该蛋白可能同时参与了AFLD的发生和白藜芦醇的AFLD保护作用。目前,尚未发现SerpinB1a蛋白与酒精性肝损伤及白藜芦醇保护作用相关文献报道,值得进一步关注和探讨。

白藜芦醇是一种存在于多种植物中的天然多酚,作为沉默信息调节因子1(SIRT1)激动剂[22],具有抗炎、抗缺血、抗氧化、抗癌、心脏保护等调节作用[23]。研究发现,白藜芦醇可通过促进自噬以减少酒精诱导的肝脏脂肪变性[6],下调缺氧诱导因子和细胞色素P4502E1(CYP2E1)表达,减少活性氧(ROS)等有害物质产生[24],加速巨噬细胞极化以抗凋亡[25],发挥酒精性肝损伤保护作用。但截至目前,其具体的分子干预机制尚不清楚。人类SerpinB1(小鼠SerpinB1a的功能同源物)与多种疾病有关,如2型糖尿病患者血清SerpinB1水平明显升高与胰岛B细胞功能障碍、血糖控制和血脂异常有关[26],SerpinB1通过调控生长因子信号通路促进胰岛B细胞增殖以应对胰岛素抵抗[27]。MOURAD等[28]检测了葡聚糖硫酸酯钠诱导的炎症性结肠炎模型小鼠的结肠蛋白表达情况,发现SerpinBla表达上调并参与先天免疫反应。运用蛋白组学串联质谱标签(TMT)和生物信息学技术发现早期大鼠急性胰腺炎中SerpinB1a低表达,并通过减弱对弹性蛋白酶的抑制发挥抗炎作用[29]。在癌症领域也显示,过表达SerpinB1会促进口腔癌细胞在侵袭性口腔鳞状细胞癌中的转移[30],相反地,在乳腺癌、肺癌与肝细胞癌等癌组织中SerpinB1表达增强并抑制基质金属蛋白酶2活性,从而发挥抑癌作用[31-32]。由此可见,SerpinB1a与多种疾病发生或保护作用有关,涉及免疫防御、蛋白水解、抑癌或促进癌细胞扩散等多种反应,在不同疾病中存在正性或负性表达的差异性。本研究发现在慢性酒精摄入后,肝脏SerpinB1a表达水平明显下调和经白藜芦醇干预后SerpinB1a表达水平明显上调,这提示有必要进一步证实其是否真的参与了AFLD发生的保护作用及其机制。

与4D非标定量蛋白质组学检测结果模式一致,靶向蛋白质组定量技术验证了SerpinB1a蛋白表达在AFLD小鼠肝组织明显下调,提示该蛋白在AFLD发生中的保护作用,白藜芦醇干预后SerpinB1a蛋白表达明显上调可初步证明这一点。根据前言所述,在研究基于AFLD疾病阶段的肝脏自噬抑制作用,以及经FOXO1和pSTAT3介导的酒精摄入引起的肝损伤与SerpinB1a的调控关系基础上,作者提出了SerpinB1a在酒精诱导的肝损伤保护中可能通过FOXO1-STAT3介导的自噬信号通路发挥作用。已知FOXO1通过正向调控应激诱导蛋白3以抑制mTORc1、增强自噬相关基因(ATGs)的表达,实现自噬诱导的调控[11]。SINGH等[33]在肝细胞中对ATG7基因进行特异性敲除,并检测了肝组织中甘油三酯水平,以研究自噬是否参与了脂质分解代谢,结果显示:在抑制自噬后肝脏中甘油三酯积累明显增多。相反,激活自噬有助于肝细胞中脂质的分解,通过脂吞噬或微脂噬两种自噬形式,从而减少肝细胞中脂肪变性[34]。除了参与调控自噬和脂质分解代谢的调节,FOXO1还能降低过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的转录活性,减少游离脂肪酸的摄取,并抑制脂肪酸合成酶和乙酰辅酶a羧化酶1的表达,从而抑制脂肪的合成并减少肝脏中甘油三酯的积累[35-36]。此外,FOXO1的表达下调会降低超氧化物歧化酶(SOD)生成,加重氧化应激发生[37]。基于SerpinB1a与FOXO1、PPARγ的关系[10-11,35-36],以及抗氧化应激、自噬诱导在白藜芦醇抗酒精性肝损伤的研究发现[6,24],作者认为上调SerpinB1a的表达、经FOXO1介导的PPARγ拮抗作用及自噬诱导可能是白藜芦醇发挥AFLD保护作用的重要机制。此外,作为肝保护信号的信号转导和转录激活因子3(STAT3),既可以通过上调Bcl-2互作蛋白3的表达诱导自噬[11],进而促进脂肪分解,减少脂肪变性,还可以通过抑制SREBP-1c的表达来抑制脂肪合成[38]。因此,SerpinB1a的肝脏保护作用也可能是通过激活肝细胞中的STAT3,进一步激活自噬以加快脂肪分解,并抑制SREBP-1c表达以减少脂肪生成来发挥的。

综上所述,本文探讨了SerpinB1a表达水平与AFLD发生的关系,提出了SerpinB1a可能作为FOXO1、STAT3介导的自噬诱导上游调控因子,其表达水平的变化参与了AFLD的形成及白藜芦醇的抗AFLD作用,但还需要进一步验证。总之,本文为完善AFLD发生的分子机制及探讨白藜芦醇的AFLD保护机制提供了科学的实验室依据。