王卫国,马 芳,王伟伟,张 夏,吴仲峰,李玉云

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖的血液细胞肿瘤,目前仍不可治愈。免疫表型的差异是区分正常和异常浆细胞的基础,高表达的抗原也可以成为免疫治疗良好靶标[1-2]。当前推荐标记浆细胞的抗原为CD38和CD138[3],但CD138在MM细胞中不是全部表达、在老化细胞中表达迅速下降以及CD138靶向治疗的应用,需要寻求一些新的抗原来识别MM细胞。信号淋巴细胞激活分子(signaling lymphocytic activation molecule,SLAM)家族受体属于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白,参与先天性和适应性免疫反应的调节,调控免疫细胞的增殖和细胞因子的产生,主要由CD48、CD84、CD150、CD229、CD319和CD352等分子组成[4-6]。SLAM家族受体成员在MM细胞中如何表达及在诊疗中的价值,目前国内鲜有相关报道,本研究旨在探讨SLAM家族受体成员在MM细胞中表达的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择 2019年1月至2020年7月在阜阳市人民医院诊断的MM病人32例,男20例,女12例,平均年龄(64.5±8.2)岁,诊断标准依据《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》[7]。另择20例良性血液病病人作为对照组,其中缺铁性贫血10例、巨幼细胞性贫血8例和感染病人2例,男12例,女8例,平均年龄(59.6±12.1)岁。2组间性别、年龄差异均无统计学意义(χ2=0.03、t=1.74,P>0.05)。

1.2 仪器和试剂 FITC-CD38,PE标记CD138、CD48、CD84、CD150、CD229、CD319和CD352,APC标记CD56和CD19,CD45-PerCP等荧光标记单克隆抗体,分别购自BD Biosciences公司和BioLegend公司;FACS Calibur流式细胞仪和溶血剂购自BD Biosciences公司。

1.3 浆细胞SLAM家族受体表达检测 抽取入组者骨髓2 mL,肝素抗凝,计数并调整细胞浓度为(10～20)×109/L。采用四色抗体组合,每个流式管的骨架抗体为CD45、CD38、CD19或CD56,各检测管中分别加入CD138、CD48、CD84、CD150、CD229、CD319和CD352,抗体用量5 μL,再加入25 μL的骨髓,室温染色15 min,加入溶血素溶血10 min,离心后弃上清液,磷酸盐缓冲液洗涤1次,加缓冲液重悬细胞后上机检测。采用Cell quest软件分析,侧向光射门除去细胞碎片,利用CD45/CD38/CD56或CD19联合设门圈出浆细胞,再分析SLAM家族受体成员的表达,以抗原表达频率≥20%为阳性、<20%为阴性,并记录平均荧光强度(MFI)、MFI中位数和变异系数(CV)。

1.4 统计学方法 采用χ2检验、t(或t′)检验、单因素方差分析、q检验和Pearson相关分析。

2 结果

2.1 SLAM家族受体成员表达频率比较 与对照组的正常浆细胞比较,MM细胞CD150和CD352表达频率降低(P<0.01),CD48、CD84、CD229和CD319表达频率差异无统计学意义(P>0.05)(见表1);但CD84仅为部分表达,不适合做进一步分析。

表1 MM细胞和正常浆细胞SLAM家族受体成员表达频率比较

2.2 MM细胞、粒细胞和淋巴细胞群CD48、CD229和CD319 MFI比较 MM细胞群CD48、CD229和CD319的MFI高于淋巴细胞群(P<0.01),也高于粒系细胞群(P<0.01)(见表2)。

表2 MM细胞、淋巴细胞和粒系细胞CD48、CD229和CD319 MFI比较

2.3 MM细胞CD48、CD229和CD319 MFI CV的比较 MM细胞CD319 的MFI CV(52.58±10.14)低于CD229(73.63±25.49)和CD48(69.04±12.74)(t′=4.34、t=5.72,P<0.01)。

2.4 CD48、CD229和CD319分辨率度量比较 CD48、CD229和CD319荧光强度能否区分MM细胞群和粒细胞群,采用分辨率度量(resolution metric,Rd)[Rd=(MM细胞MFI中位数-粒系细胞MFI中位数)/(MM细胞SD+粒系细胞SD)]进行评估。CD48、CD229和CD319的Rd分别为0.90±0.35、0.85±0.41和1.23±0.32,3种抗原表达在MM细胞中Rd均可与粒系细胞群区分,CD319的Rd高于CD48和CD229(t=3.94、t=4.13,P<0.01)。

2.5 CD48、CD229和CD319设门与参考设门分析MM细胞比例 MM细胞的参考设门方案为CD38/CD45/CD138(欧洲骨髓瘤网络)。Pearson相关性分析显示:CD48/CD45/CD38、CD229/CD45/CD38、CD319/CD45/CD38和参考设门分析得到的MM细胞百分比明显呈正相关(r=0.961、0.953和0.981,P<0.05)。

2.6 储存稳定性比较 选择9份MM样本,储存在4 ℃冰箱,于48 ～72 h再次检测MM细胞CD138、CD48、CD229和CD319的表达频率。与48 h内检测的结果相比,CD138的阳性频率明显降低(P<0.01),而CD48、CD229和CD319阳性频率差异均无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3 MM细胞CD138、CD48、CD229和CD319储存前后的阳性频率(%)

3 讨论

正常浆细胞为多克隆性,但其膜抗原表达具有异质性[8-9]。随着诊疗的发展,需要寻求一些能替代CD138的抗原用于浆细胞的检测[10-12]。SLAM家族受体成员特异性表达于造血细胞,对免疫细胞增殖和功能的调节也起着重要作用[13],而免疫细胞的失衡与感染、肿瘤和自身免疫病等关系极为密切[14-15]。近年来,SLAM家族受体成员的表达与肿瘤和感染的关系备受关注,在MM细胞中的表达方式也是研究的热点。

本次实验发现:较正常浆细胞,MM细胞CD150和CD352表达降低;而CD48、CD229和CD319在正常和异常浆细胞中绝大多数为强表达。结果表明CD150和CD352表达降低可以当作异常浆细胞的特征,并提示CD48、CD229和CD319或许可以用于标记MM细胞。若一种抗原在多种血细胞中均表达,MFI和Rd水平是FCM区分细胞最有价值的指标,尤其是Rd。通过分析MFI发现,MM细胞CD48、CD229和CD319的MFI均明显高于粒系细胞和淋巴细胞,利用MFI可以将MM细胞区分出来。CD45阴性和低侧向散射光区域为红系细胞和红细胞碎片,从本实验流式图上能看出该区细胞几乎不表达CD48、CD229和CD319,这种表达方式对识别CD45阴性的MM极为有利。异常浆细胞也可以位于CD45弱阳性区域,且侧向散射光稍高,和粒系细胞的位置可能有所重叠,但不会与成熟淋巴细胞有重叠[16]。利用Rd分析发现,MM细胞CD48、CD229和CD319的Rd水平,可以将MM细胞从粒系细胞中区分出来,在CD45或CD38的双参数散点流式图上显现得较为明显,但CD319的MFI CV较低且Rd更高,显示出更强的区分力。CD45/CD38/CD138联合设门分析浆细胞比例是目前推荐的FCM方案[3]。以CD45和CD38为骨架抗体,利用CD48、CD229和CD319分别替代CD138,分析MM细胞的百分比,发现检测结果和参考方法具有很好的相关性,其中CD319为最高。这些结果显示出CD319在识别MM的可用性。

用于FCM检测骨髓样本,推荐肝素抗凝,虽然4 ℃可存放72 h,但检测MM细胞一般要求不超过48 h[17]。9个MM样本储存在4 ℃,在48 h内和48～72 h时间时间段再检测发现:与48 h时内检测结果相比,在48～72 h时段检测,MM细胞CD138阳性表达降低,而CD48、CD229和CD319表达频率差异无统计学意义,显示CD48、CD229和CD319在储存过程中表达较为稳定,也提示随着样本的老化,用CD138设门会低估MM细胞的比例。

总之,SLAM家族受体成员在MM细胞的表达中具有临床应用价值。异常浆细胞CD150和CD352表达减低。CD319在MM细胞中高表达、Rd较高、CV较低、与经典方法所获取MM细胞比例的相关性好和储存过程中表达稳定,是一种可用于MM细胞的标记抗原。