李笑妍 周筱慧 董河 董铭心

(1 青岛大学附属医院麻醉科,山东 青岛 266075; 2 青岛大学药学院)

吗啡作为经典的阿片类镇痛药物在临床中应用广泛,具有强效镇痛作用［1］。然而吗啡在发挥强大镇痛作用的同时,也会产生药物耐受、呼吸抑制、便秘、成瘾等副作用,极大地限制了其临床使用［2-4］。因此,如何在使用吗啡镇痛时尽可能减少其副作用发生,成为目前学界研究的重点问题。既往研究发现吗啡主要通过激活μ阿片受体(MOR)发挥镇痛作用,但是此过程也导致了吗啡的副作用［5］。MOR羧基端包含了11个丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的关键磷酸化位点,当阿片类药物激活受体时,这些位点可被G蛋白偶联受体激酶(GRKs)和蛋白激酶C磷酸化［6］,而羧基端多位点磷酸化是促进MOR脱敏和内吞的关键因素［7］。本课题组前期基于MOR羧基端的375STANT379磷酸化位点设计并合成了多肽TAT-Q368-T379［8］,本研究以该多肽作为研究工具,探讨MOR羧基端的375STANT379关键磷酸化位点对受体下游G蛋白信号通路以及β-arrstin2信号通路的影响,为开发能够与吗啡联用以增强镇痛作用的药物提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞与质粒 HEK-293细胞购自北京中科质检生物技术有限公司,MOR质粒来源于上海联慧脑智工程研究中心,pGloSensorTM-22F cAMP质粒购买于美国Promega公司,MOR-C端标记Nanoluc质粒、β-arrestin2-N端标记EYFP质粒由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2试剂与仪器 医用盐酸吗啡购买于东北制药集团沈阳第一制药有限公司,DAMGO购买于美国AbMole公司,Forskolin购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Cmpd101购买于北京偶合科技有限公司,HA-Tag抗体购买于美国Cell Signaling technology公司,Alexa Fluor 555标记的驴抗小鼠抗体购买于上海碧云天生物技术有限公司,正置双光子全光谱快速扫描共聚焦显微镜购买于日本Nikon公司。

1.2 HEK-293细胞培养

将HEK-293细胞置于含体积分数0.10的胎牛血清和100 kU/L青霉素和链霉素(1∶1)混合液的DMEM培养基中,置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱培养,隔天传代一次,待HEK-293细胞传到第8代且细胞融合度约90%时用于后续实验。

1.3 GloSensor cAMP生物传感器测定cAMP的含量

将HA-MOR质粒与pGloSensorTM-22F质粒共转染至HEK-293细胞中,转染24 h后,在96孔板每孔接种100 μL的细胞悬液,培养24 h后丢弃培养基,换成平衡培养基(不含酚红的DMEM培养基和2%的GloSensor cAMP试剂原液)于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中孵育30 min,孵育完成后,将细胞分为6组并进行如下处理:①A组:每孔加入100 μL不含酚红DMEM培养基;②B组:每孔加入90 μL不含酚红的DMEM培养基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚红DMEM培养基;③C组:每孔加入90 μL不含酚红DMEM培养基后分为7个亚组,各亚组加入含浓度10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L吗啡(后文以浓度梯度10-11～10-5mol/L吗啡代指)的10 μL不含酚红DMEM培养基;④D组:每孔加入80 μL不含酚红的DMEM培养基,然后加入溶解有0.5×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚红DMEM培养基后,下设7个亚组,各亚组分别加入含浓度10-11～10-5mol/L吗啡的10 μL不含酚红DMEM培养基;⑤E组:每孔加入80 μL不含酚红DMEM培养基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚红DMEM培养基后,下设7个亚组,各亚组分别加入含浓度10-11～10-5mol/L吗啡的10 μL不含酚红DMEM培养基;⑥F组:每孔加入80 μL不含酚红DMEM培养基,然后加入溶解有2×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚红DMEM培养基后,下设7个亚组,各亚组分别加入含浓度10-11～10-5mol/L吗啡的10 μL无酚红DMEM培养基。除A组外,B～F组每组分别加入含浓度10-5mol/L Forskolin的1 μL不含酚红DMEM培养基,孵育15 min,最后用多功能酶标仪测定A～F组细胞全波长化学发光强度(LI)。通过计算药物作用以后的cAMP抑制率以反映药物对于MOR下游G蛋白依赖性信号通路的激活的程度,cAMP抑制率=［(LIForskolin组-LI空白组)-(LI药物处理组-LI空白组)］/(LIForskolin组-LI空白组)×100%。每组分别设置3个复孔,实验需重复3次,结果取均值。多肽TAT-Q368-T379由本课题组前期构建［8］。

1.4 蛋白质相互作用分析法测定吗啡激动MOR后对β-arrestin2的募集效应

将MOR-C端标记Nanoluc的质粒和β-arrestin2-N端标记EYFP的质粒共转染至HEK-293细胞中。转染24 h后,在96孔板每孔中接种100 μL的细胞悬液,于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中孵育过夜。24 h后丢弃培养基,将细胞分为5组并进行如下处理:①G组:每孔加入90 μL不含酚红的DMEM培养基;②H组:每孔加入80 μL不含酚红DMEM培养基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚红DMEM培养基;③I组:每孔加入80 μL不含酚红DMEM培养基以后,下设8个亚组,各个亚组分别加入含浓度10-11～10-4mol/L吗啡的10 μL不含酚红DMEM培养基;④J组:每孔加入70 μL不含酚红的DMEM培养基,再加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚红DMEM培养基后,下设8个亚组,各亚组分别加入含浓度10-11～10-4mol/L吗啡的10 μL不含酚红DMEM培养基;⑤K组:每孔加入70 μL不含酚红的DMEM培养基,再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的10 μL不含酚红DMEM培养基后,下设8个亚组,各亚组分别加入含浓度10-11～10-4mol/L吗啡的10 μL不含酚红DMEM培养基。G～K组每孔加入溶解有Nluc底物(1∶1 000)的10 μL不含酚红DMEM培养基孵育3 min,然后使用多功能酶标仪测定G～K组在波长460 nm处的LI以及540 nm处的荧光强度(FI)。计算每孔的净BRET值以反映药物对MOR下游β-arrestin2信号通路的激活的程度,净BRET值=FI药物处理组/LI药物处理组-FI空白组/LI空白组。每组设3个复孔,实验重复3次,结果取均值。

1.5 细胞免疫荧光染色法测定吗啡激动MOR后受体内吞水平的变化

将瞬时转染表达HA-MOR的HEK-293细胞接种在放置于24孔板中的多聚赖氨酸包被的玻片上生长过夜。24 h后丢弃培养基,将识别MOR氨基端HA标签的一抗(1∶100)稀释于DMEM培养基中并在37 ℃下培养细胞1 h,随后将细胞分为4组并进行如下处理:①L组:每孔加入2 mL DMEM培养基;②M组:每孔加入1.9 mL DMEM培养基,再加入含10-5mol/L吗啡的100 μL DMEM培养基;③N组:每孔加入1.8 mL DMEM培养基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的100 μL DMEM培养基,再加入含10-5mol/L吗啡的100 μL DMEM培养基;④O组:每孔之中加入1.8 mL的DMEM培养基,然后再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的100 μL DMEM培养基,再加入含10-5mol/L吗啡的100 μL DMEM培养基。完成药物处理后用40 g/L多聚甲醛固定L～O组细胞,将Alexa Fluor 555标记的驴抗小鼠二抗(1∶500)稀释于DMEM培养基中,然后孵育L～O组细胞1 h。通过荧光在共聚焦显微镜下对L～O组MOR进行细胞定位,检测细胞的平均荧光强度,以细胞表面受体荧光强度表示吗啡激动MOR后受体内吞水平的变化。每组选用45～50个细胞,每组实验重复3次。

1.6 统计学分析

使用GraphPad Prism软件处理数据,得到量效关系曲线并拟合出各分组中吗啡的效价参数半数最大有效浓度(EC50)和效能参数最大效应(Emax)。使用SPSS软件进行统计学分析,各组间EC50值、Emax值及半定量分析指标差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 多肽TAT-Q368-T379对吗啡激活MOR下游G蛋白依赖性cAMP信号通路的影响

通过C～F组及其7个亚组的cAMP抑制率拟合量效关系曲线得出,C～F组细胞EC50值分别为2.33±0.73、1.34±0.45、0.49±0.08、0.38±0.07,组间比较差异有显著性(F=13.12,P<0.05);与C组比较,D、E、F组细胞的EC50值均显著减小(P<0.05)。

2.2 多肽TAT-Q368-T379和Cmpd101对吗啡激活MOR下游β-arrestin2信号通路的影响

通过I～K组及其8个亚组的净BRET值拟合量效关系曲线得出,I～K组细胞的Emax值为0.23±0.00、0.17±0.01、0.12±0.00,组间比较差异具有显著性(F=185.95,P<0.05),与I组比较,J、K组细胞的Emax值均显著减小(P<0.01)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379对吗啡诱导的MOR内吞的影响

共聚焦成像结果显示,与L组相比,M组细胞可观察到MOR发生明显内吞,而N、O组细胞内吞的MOR明显比M组减少(图1)。L～O组细胞的表面受体荧光强度分别为100.00±13.11、81.28±10.56、92.58±12.86、93.72±13.30,组间比较差异有显著性(F=17.46,P<0.05);与L组比较,M组细胞表面受体荧光强度显著减小(P<0.01),与M组进行比较,N、O组细胞表面受体荧光强度均显著增高(P<0.01)。

图1 各组HEK-293细胞中MOR内吞水平的比较

3 讨 论

MOR是一种Gi/o亚型的G蛋白偶联受体。当MOR与其激动剂在细胞内结合后,活化的MOR通过Gα蛋白发出信号,抑制腺苷酸环化酶活性并减少cAMP积累,通过G蛋白的βγ亚单位激活内向整流K+通道和抑制电压门控Ca2+通道,从而产生镇痛作用［9-10］,细胞内活化的MOR也被GRKs磷酸化,导致β-arrestin2募集,从而启动MOR脱敏、内吞和再循环过程［6］。研究发现,β-arrestin2敲除小鼠表现为阿片类药物诱导的镇痛作用增强,药物耐受、呼吸抑制和便秘均得到改善［11-13］。后续关于β-arrestin2敲除小鼠的研究再次证实了MOR下游β-arrestin2信号通路对阿片类药物的镇痛作用及药物耐受至关重要［14-15］,但是对呼吸抑制、便秘的作用具有一定争议［7］。

MOR羧基端具有多个Ser、Thr关键磷酸化位点,受体下游信号通路传导的效率能够受到多位点的调节［16］。通过定量质谱以及细胞生物学分析发现,375STANT379基序是阿片类药物介导MOR磷酸化的关键位点［17］。有研究通过Western blot实验检测MOR激动剂诱导的Thr370和Ser375位点磷酸化证实了上述观点［18］。阿片类药物活化MOR后介导的受体羧基端位点磷酸化是分层次进行的,首先是Ser375位点发生快速并且显著的磷酸化,随后则依次是Thr370、Thr379及Thr376位点的磷酸化［19-21］。最近有研究发现,HEK-293细胞中GRK2以及GRK3能够明显促进包括375STANT379位点在内的MOR多位点磷酸化以及MOR内吞［20-22］,并且Thr370、375STANT379位点对于MOR脱敏、内吞以及β-arrstin2募集均是必要的［21］。

大部分研究通过使用转基因小鼠间接证明了MOR羧基端375STANT379位点磷酸化在受体下游细胞信号通路中的作用,但这种情况下不能排除参与MOR调节的其他信号蛋白的磷酸化。本课题组前期根据MOR羧基端的375STANT379磷酸化位点设计合成了多肽TAT-Q368-T379,实验结果显示,多肽TAT-Q368-T379与吗啡联合使用时,能够明显增强吗啡的镇痛作用,说明375STANT379磷酸化位点与吗啡的镇痛相关［8］。为探究多肽TAT-Q368-T379发挥作用的分子机制,本文研究了该多肽对吗啡介导的MOR下游细胞信号通路的影响。

在本研究中,通过GloSensor cAMP生物传感器检测发现,多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用能够使吗啡的cAMP抑制率明显增高,即多肽增强了MOR下游G蛋白信号通路的激活。说明多肽在一定程度上可以防止吗啡脱敏的发生。这一结论也与本课题组前期的体内实验结果相一致［8］。蛋白质相互作用分析法和细胞免疫荧光染色法分析显示,在HEK-293细胞中GRK2/3抑制剂Cmpd101能够明显减少吗啡诱导的β-arrestin2募集和MOR内吞,这也与既往研究的观点一致［16,23］。同时,本研究显示,基于MOR羧基端375STANT379磷酸化位点设计的多肽TAT-Q368-T379可以起到与Cmpd101类似的作用,因此推测HEK-293细胞中多肽可能通过竞争性抑制375STANT379位点的磷酸化,从而阻止β-arrestin2募集和MOR内吞。此机制可通过进一步的蛋白免疫印迹实验进行验证。关于在动物体内β-arrestin2招募与阿片类药物副作用的关系,包括药物耐受、便秘和呼吸抑制等,也可进一步将多肽与吗啡联合应用于相关的动物模型中进行验证。

综上所述,基于本课题组前期所设计的多肽TAT-Q368-T379,本研究证实了该多肽干预能够在MOR下游G蛋白信号通路和β-arrestin2信号通路中发挥重要作用,此为增强阿片类药物镇痛作用及改善药物副作用提供了新思路。

作者声明：董河、董铭心、李笑妍参与了研究设计;董铭心、李笑妍、周筱慧参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。