林春凤，熊清，宁潇雨，洪文谦，林凡，张玉琴，郑海音*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和胆汁淤积性肝病等病变长期慢性刺激肝脏，引起损伤和修复反应失调，使细胞外基质的合成大于降解，沉积异常，最终改变肝脏结构和/或功能［1］。肝纤维化会进一步导致为肝硬化，严重者会导致肝癌和肝衰竭等。针对肝纤维化的有效治疗可以预防和延缓其向肝硬化进展，但是由于早期抗病毒治疗效果较差、抗炎时间长及戒酒难度大，晚期肝移植的供体来源困难及术后风险等原因，临床上亟须更有效的防治手段［2］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）是主要由三七、麝香、牛黄和蛇胆等组成的中成药，具有解毒清热、消肿散结、活血化瘀的作用，临床上可用于抗炎［3］、抗自身免疫性疾病［4-5］、抗脑损伤［6］、保肝［7］、抗肝纤维化［8］及抗肿瘤［9-11］等。片仔癀的临床研究已取得较大进展，但其抗肝纤维化的药理作用机制尚未完全阐明。

网络药理学是建立在药物、靶点以及疾病之间相互作用关系网基础之上，通过网络分析手段，从整体上去探索中药的基本特征，观察药物对疾病网络的影响以及药物之间的相互作用关系［12］，其在中医药研究领域的应用日趋成熟。本研究在片仔癀前期工作的基础上［8，13-14］，运用网络药理学方法，结合体内实验验证，探究片仔癀治疗肝纤维化的作用靶点及可能机制，为临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物-成分-靶点网络构建 运用TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（http：//bidd.group/TCMID/）、Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中国知网（https：//www.cnki.net）等数据库对片仔癀组方主要药物三七、牛黄、蛇胆、麝香进行活性成分检索。通过口服生物利用度（OB）和类药性（DL）进行筛选，选取同时满足OB≥30%、DL≥0.18的化学成分作为候选活性成分，导入UniProt数据库获取靶点基因名称，获得片仔癀活性成分的潜在靶点。将筛选出的活性成分及对应潜在靶点上传至Cytoscape 3.7.2软件构建药物-成分-靶点网络图。

1.2 肝纤维化疾病靶点的预测 以“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为关键词，分别在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）疾病靶点数据库中检索与肝纤维化相关的靶点，删除重复项目。

1.3 片仔癀-肝纤维化靶点网络的构建及核心靶点分析 将片仔癀靶点与肝纤维化交集得到共同靶点，并绘制韦恩图。随后将共同靶点在STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建PPI（Protein-Protein Interaction Networks）网络，在Cytoscape 3.7.2软件中进行网络拓扑学分析获得核心靶点。

1.4 GO富集分析和KEGG信号通路分析 将筛选得到的靶点，通过BioMart（http：//www.biomart.org）转换成Gene Stable ID，再利用OmicShare（https：//www.omicshare.com）平台进行GO和KEGG动态富集分析。

1.5 实验方法

1.5.1 实验动物 选择6～8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠24只，体质量（20±2）g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物房，适应性喂养1周后用于实验。该动物实验方案经福建中医药大学动物伦理委员会批准（伦理审批号：FJTCM-IACUC-2022019）。

1.5.2 实验药物及试剂 片仔癀（漳州片仔癀药业股份有限公司，货号：Z35020243）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：C009-2-1、C010-2-1）；EGFR一抗（英国abcam公司，批号：ab52894）；JAK1一抗（英国abcam公司，批号：ab133666）；STAT3一抗（美国CST公司，批号：D3Z2G）；p-JAK1一抗（美国CST公司，批号：D7N4Z）；p-STAT3一抗（英国abcam公司，批号：ab76315）；GAPDH一抗（美国CST公司，批号：D16H11）。

1.5.3 实验仪器 高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；光学显微镜（日本尼康公司，型号：ECLIPSE511）；化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司，型号：Universal Hood）；酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS公司，型号：352型）；石蜡包埋机（中国亚光医用公司，型号YB-7LF）。

1.5.4 造模、给药及取材 小鼠采用随机数字法分为正常对照组、模型组和片仔癀组，每组8只。除正常对照组外，余均予CCl4∶花生油（1∶9）溶液5 mL/kg腹腔注射诱导HF模型［14］，每周2次，连续给药4周，以肝组织病理形态具有炎症浸润及纤维化特点为造模成功标准。片仔癀溶于0.9%氯化钠溶液，配制成0.023 4 g/mL溶液。在造模同时，片仔癀干预组每日以0.234 g/kg片仔癀药液灌胃。除正常对照组外，均予高脂饲料。取材前，每只小鼠腹腔注射20%乌拉坦溶液（0.5 mL/kg）麻醉后摘眼球取血，随后取出肝脏，称取肝脏质量，计算肝指数。

肝指数＝肝脏质量/体质量×100%

1.5.5 肝组织HE染色及Masson染色 各小鼠肝大叶，切成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，4%多聚甲醛浸泡，固定24 h，石蜡包埋，切片，常规脱蜡至水，分别进行HE染色和Masson染色（操作步骤按试剂说明书），中性树胶封固镜检。

1.5.6 指标检测 用高速离心机离心后取上清即为血清，用ALT、AST检测试剂盒参照使用手册进行测定。取小鼠肝组织，液氮研磨后加入裂解液，冰上静置30 min，12 000 r/min，离心15 min，取上清液，测定浓度后，4∶1加入蛋白上样缓冲液，100 ℃变性5 min后，上样，电泳，转膜，封闭，TBST清洗3次×5 min，孵育一抗［EGFR（1∶1 000）；JAK1（1∶1 000）；STAT3（1∶1 000）；p-JAK1（1∶1 000）；p-STAT3（1∶1 000）；GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃摇床过夜；TBST清洗，孵育二抗（1∶10 000）1 h，TBST清洗，显影液1∶1配置后显影。

1.5.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据处理。计量资料服从正态分布以（）表示，2组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 片仔癀的活性成分与药物靶点筛选 通过TCMSP等数据库检索并筛选，获得片仔癀的有效化学成分共31种，删去重复项后共24种，见表1。根据度值和中介中心性排序获得主要活性成分有槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇等。筛选出片仔癀活性成分的不重复作用靶点共有217个。将中药、化合物和对应靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，获得片仔癀药物-成分-靶点网络图。见图1。

图1 片仔癀药物-成分-靶点网络图

表1 片仔癀主要化学成分表

2.2 药物-疾病的共同靶点 通过GeneCards和OMIM数据库查询获得肝纤维化相关靶点7 043个。将片仔癀的靶点与肝纤维化的靶点做韦恩图取交集，得到共同靶点196个，即片仔癀治疗肝纤维的潜在靶点。见图2。

图2 片仔癀靶点和肝纤维化靶点交集韦恩图

2.3 共同靶点的PPI网络及核心靶点分析 经STRING数据库获取片仔癀治疗肝纤维化潜在作用靶点的互相作用（PPI）网络，并通过Cytoscape 3.7.2软件分析筛选核心靶点。其中以中介中心性和度值联合筛选出排名前20位的核心靶点分别为：Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL-1β、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3、HIF1A、MMP9、EGF、PPARG、FOS、CXCL8和CCND1。见图3。

图3 片仔癀治疗肝纤维化的核心靶点

2.4 核心靶点GO和KEGG通路富集分析 对片仔癀-肝纤维化的196个共同靶点进行GO富集分析，得到7 651个条目，其中生物过程（BP）6 206条，细胞组成（CC）537条，分子功能（MF）908条，取各前10个条目。图中蓝色代表生物过程，橙色代表分子功能、绿色代表细胞组分，其中免疫系统过程、细胞增殖、抗氧化活性与肝纤维化有关。见图4。

图4 片仔癀治疗肝纤维化靶点的GO富集分析

经Omicshare网站进行KEGG通路分析，获得片仔癀-肝纤维化两者共关联信号通路175条（P＜0.05）。主要涉及到癌症、糖代谢、乙型肝炎、细胞因子（TNF、IL-17）等信号通路，其中片仔癀治疗肝纤维化的核心靶点中表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体（EGFR）、信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）均富集在癌症信号通路上。见图5。

图5 片仔癀治疗肝纤维化靶点的KEGG富集分析

2.5 3组小鼠肝组织形态比较 肉眼观察发现正常对照组小鼠肝脏颜色红润，表面光滑；模型组小鼠肝脏略显黄褐色，表面粗糙有颗粒感；片仔癀组小鼠与模型组相比，表面光滑，颜色较红润。

病理组织切片HE染色结果显示：正常对照组小鼠肝组织形态正常；模型组小鼠肝细胞严重水肿，胞浆疏松淡染，以及炎性细胞浸润，纤维结缔组织大量增生，肝小叶结构破坏；片仔癀组肝细胞脂肪变性明显减少，炎性细胞浸润减少。

Masson染色结果显示：模型组肝组织内胶原纤维比正常对照组明显增多（蓝色区域），肝小叶结构破坏；片仔癀组小鼠肝纤维化程度明显减轻。见图6。

图6 各组小鼠肝及组织形态（HE染色、Masson染色，×200）

2.6 3组小鼠肝指数的影响 见图7。

图7 3组小鼠肝指数比较

2.7 3组小鼠血清ALT、AST的含量比较 见图8。

图8 3组小鼠血清ALT、AST含量比较

2.8 3组小鼠肝组织EGFR、JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3蛋白量表达的影响 见图9。

图9 3组小鼠肝组织EGFR、JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白相对表达量

3 讨 论

肝纤维化表现出乏力纳差、恶心呕吐、腹胀不适、胁肋部隐痛等症状，该病归属为“肝积”“鼓胀”“黄疸”等［15］。大多数医家均认为由湿热疫毒之邪侵扰机体，正邪交争而损伤机体，从而导致血瘀痰毒蕴结，脏腑气血阴阳失调而发病［16］。病位涉及肝、脾、肾三脏，可影响到气、血、水的运行。因此治疗上需清热解毒、活血化瘀［17］。片仔癀是主要由三七、麝香、牛黄、蛇胆等组成，具有清热解毒、消肿散结、活血化瘀、扶正祛邪的功效，其组方配伍与肝纤维化中医辨证论治中清热、化瘀、散结等治法相吻合。临床上可用于多种原因所致急慢性肝炎、肝损伤等疾患。

网络药理学分析表明，片仔癀抗肝纤维的关键靶点可能为Akt1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、JUN、IL1B、EGFR、CASP3、PTGS2、MYC、ESR1、STAT3等。进而通过GO、KEGG通路富集分析显示，主要调控的信号通路有癌症、糖代谢、乙型肝炎、TNF、IL-17等信号通路。其中，片仔癀与肝纤维化的核心靶点EGFR、STAT3富集在EGFR/JAK1/STAT3信号轴上。

癌症信号通路中的EGFR/JAK1/STAT3信号轴参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等很多重要生物学过程。EGFR近膜端有能与非受体型酪氨酸蛋白激酶（JAKs）相互作用的区域，而其远膜端能被活化的JAK磷酸化。蛋白质磷酸化和去磷酸化在控制JAK/STAT通路中起核心作用。此类受体是借助JAKs激活信号转导子和STAT而最终作用于基因的转录调节。因此，活化的EGFR可激活JAK/STAT信号发挥作用［18］。此外，研究发现，IFN-γ和IL-6等炎症因子可促进JAK/STAT信号激活，进而发挥其免疫调控功能。IL-6是机体免疫应答的重要炎症介质，IL-6结合受体后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和转录激活，最终调控炎症反应［19-20］。

肝纤维化是肝内结缔组织异常增生的病理过程，是慢性肝脏疾病向肝硬化甚至肝癌等病变的起因［21］。片仔癀临床上可用于多种原因所致急慢性肝炎、肝损伤等疾患［22-23］。ALT、AST是反映肝脏正常代谢功能的重要生化指标，当肝脏受损时，ALT及AST含量将升高。与正常对照组比，模型组小鼠血液中ALT、AST含量升高，表明模型组小鼠的肝功能受损；经片仔癀治疗后，这2种指标的含量均明显降低，表示肝脏功能有明显恢复。HE染色结果表明，模型组小鼠肝脏病理切片出现严重细胞水肿和炎症，纤维结缔组织增生，相比模型组，片仔癀干预后均明显减少；Masson染色结果显示，模型组肝组织内胶原纤维明显比正常对照组增多，而片仔癀干预后肝纤维化程度明显减轻。已有各种证据表明，JAK1/STAT3信号通路密切参与肝纤维化发生、发展，抑制JAK1/STAT3信号通路，可抑制肝星状细胞的活化和促进其凋亡，从而起到抑制肝纤维化的作用［23-24］。本研究结果表明，CCl4诱导的肝纤维化模型组，EGFR、JAK1和STAT3这3个蛋白水平表达均比正常对照组明显升高，且JAK1和STAT3磷酸化水平升高；片仔癀干预组可明显下调以上3种关键蛋白。提示经CCl4诱导的肝纤维化进展可能与EGFR/JAK1/STAT3信号轴的激活有关，片仔癀能够明显减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化状态，其抗肝纤维化作用机制可能与EGFR/JAK1/STAT3信号轴有关。

综上所述，片仔癀可以明显降低肝损伤指标的血清含量，改善肝脏纤维化的病理改变，并通过调节EGFR/JAK1/STAT3信号轴起到抑制肝纤维化进程的作用。本研究通过网络药理学研究方法，阐述了片仔癀治疗肝纤维化的相关机制，并进行了一定的实验验证。这为该方治疗肝纤维化的应用提供实验支持，可为后续深入研究提供线索。今后实验可应用片仔癀作用于有关肝纤维化的细胞如肝星状细胞、肝巨噬细胞等的体外实验研究，进一步探索其机制。