刘莹莹，阚永军，胡娟，周美兰*

（1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

太子参是石竹科的植物孩儿参Pseudostellaria heterophyllaMiq.Pax ex Pax etHoffm的干燥块根，性甘、味微苦；太子参有益气健脾、生津和润肺的功效［1］。太子参在我国具有悠久的用药历史，在福建省柘荣、江苏省句容、贵州省施秉和安徽省宣城等地均有种植，因其具有丰富的药用和营养价值，现已被列入“可用于保健食品的中药材名单”。随着太子参种植面积的日益扩大，连作障碍问题越发突出，导致品质退化、产量下降，严重影响了太子参产业的发展［2-3］。有研究表明太子参连作障碍的发生与太子参根系分泌物介导根围微生物差异变异有关［4-5］。课题组前期分别采用哈茨木霉菌、芽孢杆菌、磷细菌等3种微生物菌肥进行试验，研究发现太子参整个生长周期喷洒农药次数减少，太子参单粒重显著增加。张卓旻等［6］利用GC-MS对不同产地的太子参挥发性成分研究中发现太子参富含亚油酸、十八烷酸、棕榈酸等多种脂肪酸类成分。为了进一步评价微生物菌肥对太子参中脂肪酸组成的影响，本研究首先采用气相色谱法建立太子参脂肪酸指纹图谱，对指纹图谱中的共有峰进行GCMS定性鉴别，最后通过网络药理学方法探讨太子参脂肪酸抗炎活性的潜在作用靶点，为太子参的质量控制标准研究和抗炎作用机制研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 太子参品种为“柘参2号”，种植于福建省柘荣县英山乡福建西岸生物科技有限公司的太子参GAP种植基地（S1和S2为对照种植太子参，S3～S5为哈茨木霉菌菌肥种植太子参，S6～S8为芽孢杆菌菌肥种植太子参，S9和S10为磷细菌菌肥种植太子参）。乙醇（批号：181111），石油醚（批号：2008051），甲醇（批号：1810251）均购自西陇科学股份有限公司；乙醚（江苏强盛功能化学股份有限公司，批号：20150616）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160428）；氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160509）；三氯化硼-甲醇溶液（上海麦克林生化科技有限公司，批号：201424）；正己烷（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180424）。

1.2 仪器 气相色谱仪（型号：GC-2014，配AOC-20i自动进样器，FID检测器，日本岛津公司）；气相色谱-质谱联用仪（型号：GC-MS QP-2020NX，日本岛津公司）；气相色谱柱（型号：HP-INNOWAX，30 m×0.32 mm，0.25 µm，美国安捷伦公司）；超纯水机（型号：GZY-P20-W，湖南科尔顿水务有限公司）；高速万能粉碎机（型号：FW100，苏州江东精密仪器有限公司）；分析天平［型号：AE240S，梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；旋转蒸发仪（型号：R-100，瑞士BUCHI公司）；超声仪（型号：KQ-500DV，昆山市超声仪器有限公司）；离心机（型号：ST16R，赛默飞世尔科技公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品前处理方法的选择

2.1.1 甲酯化处理 精密称取5.00 g太子参样品粉末（过二号筛）于150 mL具塞三角瓶，加入100 mL石油醚，超声（250 W，40 kHz）30 min，取出冷却至室温，过滤，滤液减压蒸干，残渣中加入5 mL 0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，置于60 ℃水浴锅加热30 min，取出冷却至室温，加2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，置于60 ℃水浴锅加热5 min，取出冷却至室温，精密加入2 mL正己烷，然后加入2 mL饱和氯化钠溶液，振摇至反应完全，转移至15 mL离心管，1 500 r/min离心5 min，正己烷层经0.22 µm微孔滤膜过滤，即得太子参脂肪酸甲酯供试品溶液。

2.1.2 未甲酯化处理 精密称取5.00 g太子参样品粉末（过二号筛）于150 mL具塞三角瓶，加入100 mL石油醚，超声（250 W，40 kHz）30 min，取出冷却至室温，过滤，滤液减压蒸干，加2 mL正己烷溶解残渣，用0.22 µm微孔滤膜过滤，即得太子参脂肪酸供试品溶液。分别将太子参脂肪酸甲酯供试品溶液和太子参脂肪酸供试品溶液注入气相色谱仪并采集气相色谱图。见图1。

太子参脂肪酸甲酯供试品溶液的气相色谱图中色谱峰的数量较为丰富，且峰面积显著高于未甲酯化供试品溶液。提示对太子参脂肪酸进行甲酯化处理有利于太子参脂肪酸的检出，故本研究过程中太子参脂肪酸均经甲酯化处理后用于气相色谱分析。见图1A。

2.2 气相色谱条件的优化 本研究进一步对太子参脂肪酸气相色谱检测过程中的进样方式、进样口温度、柱温箱升温程序等色谱参数进行优化，优选的气相色谱参数，色谱柱：HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm）；检测器：FID检测器；燃烧气：氢气；载气：高纯氮气；载气流速：10.4 mL/min；进样口温度：250 ℃；检测器温度：280 ℃；分流比：20∶1；进样量：1 µL；柱温箱升温程序：200 ℃保持1 min，然后以4 ℃/min的速率升温至240 ℃，再以20 ℃/min的速率升温至260 ℃，保持10 min。

2.3 色谱柱的选择 按照“2.1”项下方法制备太子参脂肪酸甲酯供试品溶液，分别采用HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm）和HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm）进行气相色谱分离并采集气相色谱图。采用HP-5毛细管柱采集的太子参脂肪酸气相色谱图，在10 min左右出现明显的色谱峰堆积，分离效果不佳，并且出现较大幅度的基线漂移；采用HP-INNOWAX毛细管柱采集的太子参脂肪酸气相色谱图，色谱峰数量较为丰富，且各主要色谱峰均能得到较好的分离，故本研究选择HP-INNOWAX毛细管柱用于太子参脂肪酸的分析。见图1B。

2.4 提取溶剂的选择 分别采用乙醚、石油醚和乙醇提取太子参中的脂肪酸成分，经甲酯化处理后注入气相色谱仪并采集气相色谱图，以考察不同提取溶剂对太子参中的脂肪酸提取效率的影响。太子参乙醇提取供试品溶液的气相色谱图中几乎未检测到色谱峰，表明乙醇不适合太子参中脂肪酸的提取。太子参乙醚和石油醚供试品溶液的气相色谱图中均具有较为丰富的色谱峰，但考虑到乙醚极易挥发，且具有一定毒副作用，故本研究选择石油醚作为太子参中脂肪酸的提取溶剂。见图1C。

2.5 提取时间的考察 以石油醚为提取溶剂，分别提取15、30、60、90 min的太子参脂肪酸供试品溶液，以选择太子参脂肪酸成分的最佳提取时间。提取时间15～60 min，所得太子参脂肪酸色谱图中各主要色谱峰的峰面积逐渐增加；当提取时间增加至90 min时，各主要色谱峰的峰面积与60 min相比差异无统计学意义，因此，本研究选择太子参中脂肪酸的提取时间为60 min。见图1D。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 取同一太子参供试品（S1）溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录采集的色谱图，以9号峰为参照，测得各共有峰的相对保留时间RSD均＜1.00%，相对峰面积RSD均＜4.48%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 取同一太子参供试品（S1）溶液，按“2.2”项下色谱条件分别于0、6、12、24、48 h进样，记录采集的色谱图，以9号峰为参照，测得各共有峰的相对保留时间RSD均＜3.98%，相对峰面积RSD均＜4.68%，表明太子参供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.3 重复性试验 取同一太子参样品（S1）平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件采集色谱图，以9号峰为参照，测得各共有峰的相对保留时间RSD均＜2.99%，相对峰面积RSD均＜4.66%，表明该方法重复性良好。

2.7 GC指纹图谱的建立及共有峰标定 取不同微生物菌肥种植的太子参样品制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件采集色谱图。将不同批次太子参脂肪酸的气相色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）中，以S1样品图谱为参照色谱进行Marker峰匹配，选取“时间窗”为0.1 min，采用多点矫正法生成太子参脂肪酸气相色谱共有模式色谱图。不同微生物菌肥种植所得太子参气相色谱指纹图谱（S1～S10）与对照图谱相比相似度依次为：0.96、0.95、0.99、0.98、0.98、0.91、0.92、0.94、0.96、0.99，均＞0.91，提示不同微生物菌肥种植不影响太子参中脂肪酸类成分的组成，太子参脂肪酸气相色谱共有模式色谱图共识别获得19个共有峰。见图2、图3。

图2 不同菌肥太子参脂肪酸气相色谱图叠加图

图3 太子参脂肪酸气相色谱图共有模式

2.8 指纹图谱中各共有峰的GC-MS定性分析 采用GC-MS技术对指纹图谱中各共有峰进行定性鉴别。分别取S1、S3和S5号太子参供试品溶液进行GC-MS测定，其中GC色谱条件同“2.5”项下方法；MS条件：采用岛津QP-2020NX型气相色谱-质谱联用仪进行分析，离子源为电子轰击（EI）源；离子源温度为200 ℃；接口温度为250 ℃；溶剂延迟时间为4.00 min；检测器增益为0.73 kV；采集模式为Q1 Scan；采集间隔为0.3 s；采集速度为：2 000 amu/s；质量扫描范围为45～600 m/z。采集获得的质谱碎片信息分别采用NIST 2017和Wiley 9标准谱库进行检索。

分别对太子参脂肪酸指纹图谱中19个共有峰进行谱库检索，检索结果根据匹配度进行排序（且≥80%），选择匹配度较高的化合物并结合文献对各共有峰进行定性分析，共检索获得19个化合物，各共有峰的质谱检测结果见表1。对各共有峰的相对百分含量采用峰面积归一化法进行计算，结果显示太子参脂肪酸主要由多种不饱和脂肪酸组成，如油酸、亚油酸、亚麻酸、顺式-15-二十四烯酸、10-顺-十七碳烯酸、顺-11-二十烯酸、顺-11，14-二十碳二烯酸等，其相对占比分别为7.50%、8.06%、0.98%、0.59%、0.20%、0.67%和0.29%；同时还含有饱和脂肪酸成分，如棕榈酸、硬脂酸、十五烷酸、二十二烷酸、木蜡酸等，各成分相对占比分别为8.89%、1.01%、0.52%、0.91%和0.80%。

表1 太子参脂肪酸指纹图谱共有峰GC-MS分析结果

2.9 抗炎潜在靶点预测 将GC-MS分析获得的太子参脂肪酸获取的化学成分分别导入TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/；物种信息选择：Homo sapiens）数据库筛选潜在靶点，所得靶点经过Uniprot数据库的标准化，合并2个数据库得到的靶点，删除重复，从而获得太子参脂肪酸的潜在作用靶点。疾病靶点通过GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）以“inflammation”为关键词检索获取。将成分靶点和疾病靶点取交集，获得太子参脂肪酸抗炎的潜在靶点。将太子参脂肪酸与共同靶点基因导入Cytoscape 3.9.1，构建太子参脂肪酸免疫调节的“成分-靶点”网络，利用CytoNCA插件计算其网络拓扑学参数，并筛选出与疾病靶点相互作用的化学成分。利用Metascape平台（http：//metascape.org）针对太子参脂肪酸抗炎的潜在作用靶点进行GO富集分析，见图4A。GO富集分析包括生物过程、分子功能和细胞组成，运用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对富集获得的基因条目进行可视化处理，见图4B。

图4 太子参脂肪酸抗炎的潜在靶点网络

通过TCMSP和Swiss Target Prediction数据库共筛选获得太子参脂肪酸的作用靶点基因212个，通过GeneCards数据库检索炎症相关基因，选择相关系数较高的前400个靶点基因（相关系数不小于6.2），共获得交集靶点27个潜在靶点基因，分别为IL-6、PTGS2、PLG、ICAM1、ALB、PPARG、RELA、ITGB2、NOS2、ALOX5、ABCB1、MAPK14、MMP3、PTGS1、PPARA、MMP2、NCF1、CTSG、NR3C1、VDR、NR1H4、MMP8、MAPK1、ADAM17、LTB4R、RBP4、PTGDR2。通过对太子参脂肪酸与潜在靶点基因的互作网络进行拓扑分析，筛选获得太子参脂肪酸抗炎的核心靶点为：PPARA、PTGS1、NR1H4、PTGS2、PPARG、ALOX5等；其中贡献度较高的成分依次为α-亚麻酸、亚油酸、十六烷酸、γ亚麻酸、10-顺-十七碳烯酸、顺-11，14-二十碳二烯酸等。

3 讨 论

本研究通过对样品前处理方法、提取溶剂、提取时间、色谱柱等参数进行考察，建立的太子参中脂肪酸的GC指纹图谱的测定方法，该方法所得到的色谱峰较为丰富，峰形对称且分离度良好，采用该方法检测哈茨木霉菌、芽孢杆菌、磷细菌等3种微生物菌肥对太子参中脂肪酸组成的影响，研究发现上述3种微生物菌肥种植不影响太子参中脂肪酸类成分的组成，进一步通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统筛选获得了19个共有峰。

采用GC-MS技术实现了对太子参脂肪酸指纹图谱中各共有峰进行定性鉴别，发现太子参脂肪酸主要由多种不饱和脂肪酸组成，如油酸、亚油酸、亚麻酸、顺式-15-二十四烯酸、10-顺-十七碳烯酸、顺-11-二十烯酸、顺-11，14-二十碳二烯酸等。亚油酸乙酯已广泛应用于在抗炎、抗菌等方面，其可显著抑制炎症因子的释放［7］。亚麻酸是机体必需的脂肪酸，在降血脂、抗血栓、抑制炎症反应、抑制癌症转移等方面具有重要的生理学功能［8］。十六烷酸乙酯被报道为炎症细胞抑制剂，降低炎症渗出物中前列腺素E2的水平，并减轻角卡拉胶诱导的大鼠足肿胀，降低LPS诱导的内毒素血症大鼠血浆中TNF-α和IL-6［9］。

本研究利用网络药理学方法对太子参脂肪酸的抗炎机制进行初步探讨，共筛选获得27个潜在作用靶点。进一步筛选获得太子参脂肪酸抗炎的核心靶点，依次为：PPARA、PTGS1、NR1H4、PTGS2、PPARG、ALOX5等；太子参脂肪酸中抗炎活性贡献度较高的成分依次为α-亚麻酸、亚油酸、十六烷酸、γ亚麻酸、10-顺-十七碳烯酸、顺-11，14-二十碳二烯酸等。通过“成分-靶基因”互作网络拓扑分析，得出太子参脂肪酸抗炎的活性成分及潜在的核心靶点。

综上，本研究中建立了太子参脂肪酸成分的GC指纹图谱的测定方法，发现哈茨木霉菌、芽孢杆菌、磷细菌等微生物菌肥种植不影响太子参中脂肪酸类成分的组成，并筛选获得了19个共有峰，进一步采用GC-MS技术对各共有峰进行定性鉴别；采用网络药理学方法初步筛选了太子参脂肪酸抗炎的27个潜在作用靶点。为太子参药材的质量控制标准研究和抗炎作用机制研究提供参考。