龚伟伟，黄小贞，2，赵懿琛，2

1.贵州大学茶学院生物工程系，贵州贵阳 550025；2.贵州大学农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州贵阳550025

花烟草防御素1（Nicotiana alatadefensin 1，NaD1）是一类最初在花烟草（Nicotiana alata）花中发现的植物防御素［1］，具有高效、广谱的抗菌活性和潜在的抗肿瘤活性，与传统的抗生素比较，其抗菌活性较高，有望作为一类新型的抗菌药物应用于临床［2］。目前，已有利用原核和真核表达系统表达NaD1蛋白的研究［1，3］，但以烟草作为表达系统生产NaD1 蛋白的研究鲜见报道。NaD1 蛋白有47 个氨基酸残基，富含半胱氨酸，且含有由3 个反向平行的β 折叠和1 个α 螺旋组成的αβ 基序（CSαβ 基序），在极端pH 和温度下也可保持稳定［4］。研究发现，NaD1 蛋白可通过二聚作用和依赖细胞壁途径渗透至菌丝，进入细胞质并诱导产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO），从而对尖孢镰刀菌、黄萎病菌、白色念珠菌等真菌产生杀伤作用［5-8］；也可特异性与细胞质膜的磷酸酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）结合形成1 个拱形低聚复合物［9-10］，通过非凋亡的膜溶解过程诱导人上皮宫颈癌细胞（HeLa）、白血病T 细胞（Jurkat）、恶性黑色素瘤细胞（MM170）等哺乳动物肿瘤细胞死亡，且不会对人体细胞产生伤害，有望开发为新型抗癌药物［3，11-14］。另外，真菌细胞壁多糖甲壳素和β-葡聚糖与NaD1及其他植物防御素之间会相互作用，保护真菌免受植物防御素的侵害［15］。

可作为生物反应器的转基因植物具有完善的真核表达系统，能为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰，表达具有生物活性的外源蛋白，可应用于人或动物的疾病治疗及预防，该系统成本低、产出高，且需求大，具有广阔的应用前景［16-17］。本研究以烟草作为表达系统表达NaD1 蛋白，采用滤纸片法和CCK-8 法对高表达NaD1基因K326 烟草叶片总蛋白在体外的抑菌和抗癌活性进行检测，以期为利用烟草作为生物反应器生产抑菌和抗癌生物制剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1植株 花烟草花、野生型（WT）和高表达NaD1基因（转基因）K326 烟草叶片（NaD1基因的相对表达量为WT 的20 倍）均由贵州大学农业生物工程研究院温室提供。

1.2细胞及菌株 HeLa细胞购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心；尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和白色念珠菌（Candida albicans）均购自北京北纳生物科技有限公司。

1.3主要试剂及仪器 氟康唑片（50 mg × 6 片／盒）购自一品药业（花溪店）；增强型CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及6 mm 灭菌滤纸片均购自北京索莱宝生物科技有限公司；氯化钠（NaCl）、β-巯基乙醇、Tris-HCl及90 mm PDA平板均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；平底96 孔板（货号：31111B）购自赛伯乐（北京）仪器有限公司。

1.4烟草总蛋白的提取及鉴定 取10 g 新鲜的花烟草花、WT 及转基因K326 烟草叶片，分别置研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末状，移入30 mL 冰上预冷的缓冲液（50 mmol／L NaCl，10 mmol／L EDTA，30 mmol／L β-巯基乙醇和0.5 mmol／L 苯甲基磺酰氟，60 mmol／L Tris-HCl，pH 8.0）中，振荡混匀，冰上放置15 min；4 ℃，16 099.2×g离心15 min；取上清，重复离心1 次；取上清，置3.5 KDa 分子截留量的透析袋里，用缓冲液于4 ℃透析24 h；-80 ℃预冷2 h；冻干［13］。将3 组冻干烟草总蛋白用PBS 复溶，Bardford法测定蛋白浓度［18］，并调整至5 mg／mL，进行15%SDS-PAGE分析。

1.5烟草总蛋白对真菌抑菌活性的检测 采用滤纸片法［19］。在2块90 mm 的PDA 平板上分别滴加100 µL的尖孢镰刀菌和白色念珠菌菌液（A600= 1），涂布均匀；取5 mg／mL 1.4 项提取的3 种烟草总蛋白各8 µL，滴加至直径6 mm 的灭菌滤纸片上，室温静置1 min，将纸片放至PDA 平板上，以5 mg／mL 的氟康唑为阳性对照，PBS 缓冲液为阴性对照，每种菌设3个重复。平板倒置于28 ℃培养箱中培养24 h，统计抑菌圈直径，倒置显微镜下观察抑菌圈内的真菌生长情况，并按下式计算抑菌圈宽度。同时，于显微镜下观察阴性对照组和5 mg／mL 转基因K326 烟草叶片组白色念珠菌和尖孢镰刀菌的生长情况。

1.6烟草总蛋白对癌细胞抑制活性的检测采用CCK-8法。将HeLa细胞接种至平底96孔板中，100µL／孔，于37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%单层，更换为含不同浓度（1、5、10 mg／mL）烟草总蛋白（1.4项制备的3种烟草总蛋白）的PBS，100µL／孔，继续培养24 h［20］，同时设对照组（等体积PBS）及空白组（仅加增强型CCK-8 溶液），每组3个复孔；弃培养基，更换为完全培养基，100µL／孔，加入增强型CCK-8溶液，10µL／孔，继续孵育0.5 h；用酶标仪检测A450，按下式计算对HeLa细胞的抑制率，并获得IC50。

抑制率（%）=［1-（加药组A450-空白组A450）／（对照组A450-空白组A450）］×100%1.7统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据均以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1烟草总蛋白的鉴定 花烟草花总蛋白及WT 与转基因K326烟草叶片总蛋白经15%SDS-PAGE分析，均可见相对分子质量约16 800的目的蛋白条带，大小与预期一致，见图1，总蛋白的浓度分别为11.25、10.33和10.14mg／mL。

图1 烟草总蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of total tobacco protein

2.2烟草总蛋白对真菌的抑菌活性 转基因K326烟草叶片总蛋白在5 mg／mL 浓度下即可对白色念珠菌及尖孢镰刀菌产生明显的抑菌圈，抑菌圈内菌落明显减少；抑菌圈宽度分别为（5.67±0.31）和（9.25±0.20）mm；对白色念珠菌的抑菌活性为（85.68 ±3.08）%，分别为WT K326 烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.33和1.14倍（F=15 339，P＜0.05），对尖孢镰刀菌的抑菌活性为（148.48±2.47）%，分别为WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.09 和1.08 倍（F=4 927，P＜0.05）。见图2 和表1。与阴性对照组比较，显微镜下观察可见，5 mg／mL 转基因K326 烟草叶片总蛋白可抑制白色念珠菌和尖孢镰刀菌的生长，细胞数量大量减少，见图3。

表1 烟草总蛋白对白色念珠菌和尖孢镰刀菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effects of total tobacco protein on Candida albicans and Fusarium oxysporum

图2 烟草总蛋白对白色念珠菌（A）和尖孢镰刀菌（B）的抑菌效果（标尺：1 cm）Fig. 2 Antibacterial effects of total tobacco protein on Candida albicans(A)and Fusarium oxysporum(B)（scale：1 cm）

图3 白色念珠菌和尖孢镰刀菌生长情况的镜下观察（×40）Fig. 3 Microscopic observation on growth of Candida albicans and Fusarium oxysporum（×40）

2.3烟草总蛋白对癌细胞的抑制活性 各组总蛋白随着浓度的增大，对HeLa 细胞的生长抑菌率均逐渐明显增加（F=30 699 091，P＜0.05）。WT 和转基因K326 烟草叶片及花烟草花总蛋白对HeLa 细胞的IC50分别为（9.53 ± 0.38）、（6.11 ± 0.61）和（7.37 ±0.35）mg／mL，转基因K326 烟草叶片总蛋白的IC50最小，表明其抑制癌细胞生长的活性最好，分别是WT K326烟草叶片和花烟草花总蛋白的1.56和1.21倍（F=89 748，P＜0.05）。见表2。

表2 烟草总蛋白对HeLa细胞的抑制活性Tab.2 Inhibitory activity of total tobacco protein on HeLa cells

3 讨论

以植物作为表达系统生产外源蛋白能够表达植物本身、人类、动物、病毒及细菌蛋白质，比其他表达系统更低廉，更有效，安全性更高，且具有翻译后加工及修饰过程，使表达产物具有与高等动物细胞的表达产物一致或接近的免疫原性和生物活性［21］。利用大肠埃希菌、酵母、昆虫细胞／杆状病毒、哺乳动物细胞及动物乳腺生产外源蛋白，其表达产物的产率和活性受可溶性、稳定性、分子量大小等因素的影响，难以进行大规模生产［22］。目前，利用转基因烟草作为生物反应器表达药用蛋白、抗体和细胞因子已有大量的研究报道。LAU 等［23］报道，利用烟草表达喜马拉雅盾叶鬼臼中抗癌药物依托泊苷合成前体足叶草毒素［（-）4’-去甲-表鬼臼毒素］的6 个关键基因，可获得目标产物。韦正乙［24］通过农杆菌介导法将带有6×His标签的牛凝乳酶原基因整合至烟草基因组中，并在植物可溶性蛋白中获得了重组牛凝乳酶，浓度达0.12%～0.52%，且具有良好的凝乳活性，与市售产品活性相当。邬强［25］通过叶片注射法将外源基因转入烟草，获得了Ag85B、ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6纯化蛋白，经ELISA法检测表明，各蛋白均有良好的免疫原性。目前，利用烟草生产的抑菌肽和乙肝抗体已批准上市，另外，变异链球菌抗体（CaroRxTN）、RhinoRxTN、Fv抗体、α-半乳糖苷酶和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗体融合蛋白等已进入临床试验阶段［26］。

本研究利用烟草作为生物反应器，表达获得了含有NaD1 蛋白的K326 烟草叶片总蛋白，利用滤纸片法对烟草总蛋白的真菌抑菌活性进行检测，结果表明，与WT和花烟草花总蛋白比较，转基因K326烟草叶片总蛋白对白色念珠菌、尖孢镰刀菌及HeLa 细胞均具有显著的抑制活性，分别为WT 的1.33、1.09和1.56倍，花烟草花总蛋白的1.14、1.08和1.21倍。显微镜下观察可见，与阴性对照组比较，5 mg／mL转基因K326 烟草叶片总蛋白即可抑制白色念珠菌和尖孢镰刀菌生长，细胞数量大幅减少。CCK-8 法检测结果表明，转基因K326 烟草叶片总蛋白的IC50最小，表明其抑制癌细胞生长的活性最好，分别为WT K326 烟草叶片总蛋白和花烟草花总蛋白的1.56 和1.21倍。

综上所述，本研究以烟草作为生物反应器制备了新型抑菌和抗癌生物制剂NaD1蛋白，今后将对其进行纯化，并进一步深入研究纯化产物的生物活性。