蔺玉刚，马春玲，杨雪，龚真莉，岳亚辉，王芳萍，郜晓虹，任善会，孙跃峰，陈豪泰，焦海宏

1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州730046

人早幼粒细胞性白血病（human promyelocytic leukaemia，hPML）蛋白是一种重要的抑癌及抗病毒蛋白，最早发现于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者［1］。hPML 蛋白存在于大多数哺乳动物细胞核中［2］，与DNA损伤反应、DNA修复、端粒稳态等多种细胞生理病理过程密切相关［3-6］。

hPML 蛋白也称为三方基序结构域19（tripartite motif 19，TRIM19）蛋白，属于RBBC（RING finger，2 Bbox，coiled-coil）或TRIM家族蛋白质，包括1个环指、2个B-boxes 和1 个α 螺旋卷曲结构域［6］。hPML基因由9个主要外显子与7个选择性剪接的hPML转录本组成，形成7种hPML基因亚型Ⅰ～Ⅶ（简称hPMLⅠ～Ⅶ），均含有1个相同的N-末端区域（如修剪基序）和不同的C-末端区域［5］。研究表明，不同hPML基因亚型的生物学功能可能与其亚细胞定位有关［7］，7 种hPML基因亚型均包含关键的RBBC 结构域；除hPMLⅦ外，其他亚型在外显子6 中均含有核定位信号（nuclear localization signal，NLS）基因，并定位于细胞核中［7］。hPMLⅠ是7种转录本中最长、最完整，也是唯一既含有核输出信号（nuclear export sequence，NES）又含有NLS序列的转录本［8］；hPMLⅣ是研究中常用的基因亚型，包含除NES外所有的关键结构，如RBBC、SIM、NLS和3个关键性的小泛素相关修饰（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化位点（K65、K160 和K490），与hPMLⅠ的功能相似［9-10］；hPMLⅦ缺乏NLS，大部分定位于细胞质中［11］，hPMLⅠ～Ⅵ均定位于细胞核与细胞质中［12］；大多数hPML异构体的C-末端区域驱动可与许多蛋白和病毒相互作用，并显示出独特的自组装特性［10，13］。本研究采用RT-PCR 法扩增hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（未找到hPMLⅢ基因亚型序列，仅以6 种转录本为研究对象），构建真核表达质粒，采用Western blot法检测其在真核细胞中的表达情况，间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA）法检测重组蛋白的亚细胞定位情况，以期为hPML蛋白生物学功能的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株、载体、基因及细胞 感受态E.coliDH5α 购自深圳康体生命科技有限公司；载体pCAGGS、hPMLcDNA、293T 细胞和Vero 细胞均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

1.2主要试剂及仪器 SDS、甘油、2-巯基乙醇、溴酚蓝及2YT 固体培养基均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；DMEM 培养基购自甘肃健顺生物科技有限公司；青霉素、链霉素和庆大霉素（100×）均购自北京索莱宝科技有限公司；Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细胞转染试剂jetPRIME购自法国Poly plus公司；Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔IgG 购自美国Invitrogen 公司；兔抗Myc 单克隆抗体购自美国Cell Signaling 公司；小鼠抗β-actin 单克隆抗体购自上海诺莱生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG 均购自康为世纪生物科技股份有限公司；EcoRⅠ和KpnⅠ均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；激光共聚焦显微镜（TCS SP8）购自德国徕卡公司。

1.3细胞培养 采用DMEM培养基，于37 ℃培养293T和Vero细胞，取对数生长期细胞用于后续试验。

1.4引物设计及合成 根据GenBank中登录的hPML基因序列（NM_033238），应用SnapGene 6.0.2 软件设计特异性引物，所有扩增引物上游序列均相同，为5'-CATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGAGCCTGCACCCGCCCGATCTCCGAGGCCCCAG-3'（下划线部分为EcoRⅠ酶切位点），下游引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 用于RT-PCR扩增的下游引物Tab.1 Downstream primers for RT-PCR amplification

1.5目的基因的扩增 以hPMLcDNA 为模板扩增hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共34 个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6真核表达质粒的构建 胶回收6种hPML基因，与载体pCAGGS均经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，回收目的基因及载体片段，采用Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒于37 ℃连接30 min；连接产物转化感受态E.coliDH5α，37 ℃培养过夜；取菌液，接种至2YT固体培养基，37 ℃培养12 h；挑取单克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的真核表达质粒分别命名为pCAGGS-hPMLⅠ、pCAGGShPMLⅡ、pCAGGS-hPMLⅣ、pCAGGS-hPMLⅤ、pCAGGS-hPMLⅥ、pCAGGS-hPMLⅦ。

1.7重组蛋白hPML 的鉴定 采用Western blot 法。将293T 细胞按1.2×106个／孔加入6 孔板，于37 ℃培养24 h；用细胞转染试剂jetPRIME 分别转染6 种hPML基因真核表达质粒，继续培养24 h；用裂解缓冲液（2%SDS、10%甘油、5%2-巯基乙醇和0.1%溴酚蓝）提取总蛋白，经12% SDS-PAGE 分离后，电转移至NC 膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加入兔抗Myc 单克隆抗体及小鼠抗β-actin 单克隆抗体（均1∶1 000稀释），于37 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，加入HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（1∶1 00 稀释），室温作用1 h；ECL法显色。

1.8重组蛋白hPML的亚细胞定位分析 采用IFA法。将Vero 细胞按5×105个／孔加入12孔板，37 ℃培养24 h；用细胞转染试剂jetPRIME 分别转染6 种hPML基因真核表达质粒，继续培养24 h；PBS 洗涤3 次，用4%多聚甲醛于4 ℃固定过夜；PBS洗涤3次，用0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温透化10 min；再用5%BSA 于37 ℃恒温箱封闭1 h；加入兔抗Myc 单克隆抗体（1∶1 000 稀释），37 ℃避光孵育3 h；加入Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀释），37 ℃孵育1 h；用DAPI（1∶1 000 稀释）染色7 min，抗淬灭剂封片，干燥过夜；利用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.9数据采集与分析 应用Imagej 软件进行数据分析及作图。

2 结果

2.1目的基因的鉴定hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ基因扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分别于2 646、2 487、1 899、1 833、1 680 和1 305 bp 处可见目的基因条带，大小与预期一致，见图1。

图1 6种转录本hPML基因PCR产物电泳图Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR products of hPML gene of six transcripts

2.2真核表达质粒的鉴定 6 种真核表达质粒中的目的基因序列与GenBank 中登录的hPML基因序列（NM_033238）完全一致。表明6 种真核表达质粒构建正确。

2.3重组蛋白hPML的鉴定 hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ6种重组蛋白均可与Myc抗体发生特异性结合，分别于相对分子质量约106 000、100 000、76 000、73 000、67 000、52 000处可见特异性蛋白结合条带，大小与预期符合，见图2。表明6种重组蛋白hPML表达正确。

图2 6种重组蛋白hPML的Western blot检测Fig.2 Western blotting of six recombinant proteins hPML

2.4重组蛋白hPML 的亚细胞定位情况 重组蛋白hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ均定位于细胞核与细胞质内；重组蛋白hPMLⅦ大部分定位于细胞质中，极少定位于细胞核中。见图3。表明6 种重组蛋白hPML均成功表达，但亚细胞定位略有差异，即除重组蛋白hPMLⅦ外，其他重组蛋白均定位于细胞核中。

图3 6种重组蛋白hPML亚细胞定位的镜下观察（×10）Fig.3 Microscopic observation of subcellular localization of six recombinant proteins hPML（×10）

3 讨论

hPML 在细胞通路中具有多种功能，是抗病毒感染的首选靶点，且在干扰素抗病毒作用机制中发挥重要作用，这些作用均与其在细胞中的定位有关。本研究结果表明，各亚型hPML 蛋白不仅定位于细胞核中，细胞质中也存在，这是由于蛋白质产生于细胞质，有NLS 的蛋白会将hPML 蛋白运输至细胞核内，亚细胞定位图可显示出将蛋白质从细胞质转运至细胞核的瞬间；无NLS 的蛋白，如hPMLⅦ，其不会被运输入细胞核，在亚细胞定位图中显示大部分存在于细胞质。不同亚型hPML 蛋白可能由于定位模式不同而具有不同的功能［14］，研究表明，hPML 可通过各种不同的机制抑制多种RNA 和DNA 病毒的感染，这些机制包括通过将病毒蛋白隔离在细胞质或细胞核、抑制病毒mRNA 合成、通过在NBS 中募集和激活p53 诱导感染细胞的凋亡、用特异性组蛋白变异或表观遗传标记对病毒DNA 进行染色、对病毒或细胞蛋白SUMO 化以改变蛋白稳定性和功能［15-16］，可促进干扰素介导的信号传导及其诱导的SUMO 化、细胞凋亡、抗病毒作用，对DNA和RNA 病毒进行内在免疫［17］。如hPMLⅢ或Ⅳ蛋白的过表达可显著降低4 种血清型登革热病毒（Dengue virus，DENV）在A64 细胞中复制及肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）在HeLa 细胞感染中病毒蛋白的表达水平［18-19］。hPMLⅢ蛋白可通过p53 依赖性方式对脊髓灰质炎病毒（polio virus，PV）发挥抗病毒作用，研究表明，hPMLⅢ蛋白在p53 敲除的CHO 和U373MG 细胞中过表达可抑制水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和流感病毒在mRNA 和蛋白表达水平上的复制［16］；在人类Caco-2细胞中，hPMLⅣ和hPMLⅥ蛋白的表达具有流感病毒抗性［20］；hPMLⅢ的外源表达不会显著抵消淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）或狂犬病病毒（rabies virus，RABV）的复制，在体内也观察到hPMLⅣ亚型的抗病毒作用，如hPMLⅣ亚型缺乏会使小鼠更易感染LCMV 和VSV［21-23］；hPML 蛋白还可抑制人类巨细胞病毒的复制［24-25］。上述结论表明，hPML 蛋白具有抗病毒作用，与病毒感染和致病性密切相关，但其抗病毒机制尚未明确。

综上所述，本研究成功构建了6 种转录本hPML基因真核表达质粒，表达的重组蛋白hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ主要定位于细胞核，hPMLⅦ主要定位于细胞质。本研究为hPML 蛋白抗病毒作用的深入研究奠定了基础。