李周泉 李宇宸 唐莹 李慧 杨莉君 姜迎宏 殷丽平

(成都中医药大学 1附属医院内分泌科,四川 成都 610075;2研究生院)

糖尿病周围神经病变(DPN)是一种困扰超半数糖尿病患者造成其残疾甚至死亡、严重影响生存质量的糖尿病并发症〔1〕。雪旺细胞是一种保护神经元、促进轴突再生,起神经修复作用的胶质细胞〔2〕,它在DPN发生发展中至关重要,异常代谢因素持续损伤雪旺细胞会阻碍周围神经修复〔3〕。自噬是一种细胞适应应激,将待降解蛋白质和细胞器进行自我更新以满足代谢需要和支持细胞生长生存的过程〔4〕,研究显示调控雪旺细胞自噬可能是一种靶向治疗DPN的手段〔5〕,然而Gomez-Sanchez等〔6〕发现雪旺细胞自噬可能并非通过传统常见的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,而是通过c-JUN氨基末端蛋白激酶(JNK)信号通路实现对自噬的调节,但相关研究仍处于初级阶段〔7〕。通络糖泰方是成都中医药大学附属医院研制的一种中药制剂,由黄芪、当归、地骨皮、水蛭、蚕沙、川牛膝、玄参、赤芍和冰片等药物构成〔8〕,在临床应用上取得良好反馈,在基础研究中发现其可一定程度下调大鼠坐骨神经磷酸化(p)-JNK、JNK mRNA、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3 蛋白的表达,上调促生长因子(IGF)-1 mRNA的表达,降低大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)水平,提高大鼠感觉神经传导速度等〔9～12〕。因此本研究主要基于JNK信号通路,探讨通络糖泰方在高糖环境下对大鼠雪旺细胞自噬相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物、细胞、主要试剂及仪器 SPF级SD雄性大鼠30只,体质量200～250 g,由成都森威实验动物有限公司提供。本实验经成都中医药大学动物伦理委员会批准。大鼠雪旺细胞(RSC96) 上海赛佰康生物技术股份有限公司提供;通络糖泰方浸膏(TLTT) 成都中医药大学附属医院提供(批号20201108);甲钴胺片(弥可保,MKB) 中国卫材药业有限公司生产;细胞计数CCK-8试剂盒检测盒、重组Anti-JNK1+JNK2+JNK3抗体、重组Anti-自噬关键分子醇母Atg6同第物(Beclin)1抗体、重组Anti-微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)抗体由Abcam公司生产;细胞自噬染色检测试剂盒由北京索莱宝科技有限公司生产;辣根过氧化物酶标记兔二抗、极超敏电化学发光(ECL)试剂盒由南京碧云天生物公司生产;基因PCR引物由成都耶达科技有限公司合成;SureScriptTMcDNA第一链合成试剂盒与BlazeTaqTMSYBR Green Qpcr Mix试剂盒由美国GeneCopoeia公司生产;多功能酶联免疫分析仪由山东博科生物公司提供;实时荧光定量PCR仪由美国ABI公司提供。

1.2含药血清制备 30只SPF级SD大鼠适应性喂养3 d后,将其随机分为空白组、弥可保组和通络糖泰(通络)组,每组各10 只,弥可保组给予剂量为0.25 mg/(kg·d)MKB,通络组给予剂量10 mg/(kg·d)TLTT,空白组大鼠给予等体积生理盐水,各组均连续给药3 d。末次灌胃2 h后,无菌前提下药物麻醉后于腹主动脉取血,离心取血清于无菌离心管,经灭活灭菌处理后保存-80 ℃冰箱保存。

1.3细胞培养及分组干预 根据前期课题组数据〔13〕及预实验结果确定通络糖泰含药血清以5%、10%、20%浓度为佳,取对数生长期的雪旺细胞分为6组,按1×105/ml的密度接种于6孔细胞培养板中,并进行分组干预:空白组(5.6 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、模型组(50 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、弥可保组(50 mmol/L葡萄糖+10%含弥可保血清)、低剂量通络组(50 mmol/L葡萄糖+5%通络糖泰血清)、中剂量通络组(50 mmol/L葡萄糖+10%通络糖泰血清)和高剂量通络组(50 mmol/L葡萄糖+20%通络糖泰血清)。各组均在37 ℃、5%CO2细胞孵育箱中培养。

1.4CCK-8计数法检测各组雪旺细胞活性 将细胞以每孔5×103细胞数接种于96孔细胞培养板,共制作3块培养板(24 h板、48 h板和72 h板)。待24 h细胞贴壁后,按照分组更换培养液,每组5个复孔,24、48和72 h后按照试剂说明书滴加显色试剂继续孵育1 h,最后采用多功能酶标仪测量吸光度(A)值,每个实验重复5次。

1.5流式细胞术检测各组雪旺细胞凋亡率 将细胞以每孔1×105细胞数接种于6孔细胞培养板,待24 h贴壁后换液培养48 h,胰酶消化收集细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)润洗细胞2次,加入结合缓冲液500 μl,先后加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI),室温下避光孵育10 min,放入流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞凋亡率=早期细胞凋亡率(Q2)+晚期细胞凋亡率(Q3),实验重复3次。

1.6细胞自噬荧光染色法检测各组雪旺细胞自噬泡 根据细胞自噬染色试剂盒要求,将已更换血清并培养在6孔细胞培养板上48 h的各组贴壁细胞去除培养液,用去离子水稀释后的1× Wash Buffer清洗后直接加入单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色剂室温避光染色1 h,染色结束用1×清洗缓冲液清洗后,荧光显微镜下观察并拍照,最后用Image J进行荧光强度半定量分析,平均荧光强度=该区域荧光强度总和/该区域面积。

1.7Western印迹法检测各组雪旺细胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表达 贴壁生长并以含药血清干预48 h后的RSC96细胞,使用上样缓冲液进行裂解,经二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量后,根据10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒制备电泳凝胶后进行电泳转印、封闭处理、抗体孵育,最后通过化学发光仪获取条带影像并用ImageJ软件分析计算条带灰度值进而计算蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值,每个实验重复3次。

1.8实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组雪旺细胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ mRNA表达 引物序列由成都市耶达科技有限公司设计合成:LC3Ⅱ上游引物:5′-GACGCCTTATGTAGTGACTCGC-3′,下游:5′-TCCTGGAAAGAGGATTTTGTGGC-3′;p-JNK上游引物:5′-GCTACAAGGGTGAGAAGCAGCT-3′,下游:5′-CTGGTTCACCAGCAGGAAGAAG-3′;Beclin1上游引物:5′-CTGGACACTCAGCTCAACGTCA-3′,下游:5′-CTCTAGTGCCAGCTCCTTTAGC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游:5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。将贴壁生长并以含药血清干预48 h后的RSC96细胞,根据TRIzol法提取总RNA,根据第一链 cDNA 合成试剂盒和qPCR Mix试剂盒说明书构建体系为20 μl的互补cDNA,采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。每个样品重复实验3次。

1.9统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素分析,方差齐时采用多重比较法(Turkey),方差不齐时采用DunnettT3检验。

2 结 果

2.1雪旺细胞活性表现 与空白组比较,模型组雪旺细胞在48、72 h培养后活力显著降低(P<0.01);与模型组比较,弥可保组和高剂量通络组雪旺细胞在48和72 h培养后活力明显增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组雪旺细胞活性比较

2.2各组雪旺细胞凋亡比较 与空白组比较,其余5组凋亡细胞百分比均显著升高(P<0.01),与模型组比较,弥可保组和高剂量通络组凋亡细胞百分比明显下降(P<0.01)。见图1、表2。

图1 各组细胞凋亡比较

表2 各组雪旺细胞凋亡率、自噬泡荧光强度及p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA比较

2.3各组雪旺细胞自噬泡表现 与空白组比较,模型组自噬泡明显减少(P<0.01);与模型组比较,弥可保组和高剂量通络组自噬泡显著增加(P<0.01)。见表2、图2。

图2 各组细胞自噬泡荧光(MDC染色)

2.4各组雪旺细胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达 与空白组比较,模型组p-JNK蛋白和mRNA表达水平显著升高,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,弥可保组和高剂量通络组p-JNK蛋白和mRNA表达水平显著降低,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。见表2、图3。

1～6:空白组、模型组、弥可保组、低剂量通络组、中剂量通络组、高剂量通络组图3 各组p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达

3 讨 论

雪旺细胞是一种周围神经系统特有并主要构成有髓神经纤维髓鞘的胶质细胞,在周围神经病变中具有维持神经原有结构与功能、修复损伤和促进神经元轴突再生的重要作用〔14〕。自噬是细胞对内外环境压力变化的一种反应,在正常情况下,自噬处于相当低的水平,主要清理衰老损伤的细胞器和蛋白质转化,但当机体处于应激状态时,细胞自噬被激活,表现为自噬增强。但当刺激程度过强时,又进一步发展为自噬受损,最后自噬失败再通过凋亡途径最终促成细胞死亡〔15,16〕。若细胞发生自噬,则需要进一步检测自噬在细胞死亡中的角色:一方面,细胞通过自噬加强对功能受损的蛋白质和细胞器进行识别、降解和修复,从而抑制细胞死亡;另一方面,大量细胞实验证明自噬能诱发凋亡等非自噬性细胞死亡途径,从而促进细胞死亡〔17〕。

JNK是一类调控细胞存活、转化、增殖和死亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,JNK信号通路是细胞在生理和病理状态中的重要调节靶标和细胞信息传递交汇点〔18〕。JNK参与多种自噬和凋亡通路的调节,研究提示阻断JNK信号通路可能是预防和治疗DPN的潜在靶点〔19,20〕。糖尿病高糖环境下,机体JNK信号通路被激活,细胞从低水平自噬转向自噬增强,但持续应激状态下自噬被抑制,出现细胞凋亡直至死亡。本研究结果说明,高糖环境对细胞的刺激过强导致细胞自噬受损,通络糖泰方可能通过抑制JNK信号的活化,减少细胞凋亡,促进自噬发生。

MDC可与自噬囊泡膜上存在自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统Apg8特异性结合,因此其可判断细胞自噬过程是否发生,但MDC不仅可以与自噬体发生结合,还能与胞质内所有酸性液泡结合,因此需结合Western印迹实验进一步证明〔21〕。Beclin1是一种持续招募自噬相关蛋白介导自噬启动并参与调控自噬体双层膜形成过程的关键调节因子,LC3是自噬体膜和自噬溶酶体膜的特征性标志物,分为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ,而LC3Ⅱ是与自噬体相关唯一可靠的标记蛋白,在一定程度上可反映细胞自噬的活性,因此Beclin1和LC3Ⅱ是检测自噬水平的两种关键生物标志物〔22,23〕。本研究结果说明,高糖环境下雪旺细胞自噬活性被抑制,给予通络糖泰血清处理后,Beclin1和LC3Ⅱ表达均得到改善,说明通络糖泰方可能提高了细胞自噬活性。

综上所述,通络糖泰方可通过降低p-JNK蛋白的表达,抑制高糖环境下JNK信号通路的异常激活,提高细胞自噬活性和自噬相关蛋白Beclin1与LC3Ⅱ的表达,改善JNK信号通路参与的雪旺细胞凋亡与自噬。