柳万忠 龙煊 邓志刚

结直肠癌(CRC)是最常见的癌症之一[1],CRC病人的预后相对差,根治性手术后复发率仍然较高[2]。因此,需要寻找CRC预后相关基因,为CRC病人的预后判断提供依据。转录因子E2F2在控制细胞增殖和癌基因介导的转化中发挥重要作用[3]。Zhou等[4]报道,E2F2可能是卵巢癌的特异性治疗靶点候选。有研究表明,E2F2和B-Myb在CRC细胞中呈正相关表达,并相互影响,二者之间微妙的相互协作和相互交叉调节导致CRC的恶化[5]。黏蛋白样受体2(EMR2)在早期食管癌肿瘤中过表达,被证明与疾病侵袭性有关[6-7]。本研究检测CRC组织和癌旁组织E2F2、EMR2mRNA表达,分析二者表达与临床病理特征的关系并判断其对淋巴结转移的诊断价值。

对象与方法

一、对象

2018年1月～2020年12月间住院手术的88例CRC病人术中切除的CRC组织标本及癌旁组织标本,年龄44～74岁,平均年龄(59.14±7.79)岁。收集整理CRC病人临床资料。纳入标准:(1)经影像学、实验室检查确诊,且符合《恶性肿瘤TNM分期图谱》[8];(2)本人或家属完全了解研究内容并能配合研究;(3)随访资料齐全。排除标准:其他恶性肿瘤;心、肺、肝、肾或其他脏器功能严重损伤;自身免疫性疾病。

二、方法

1.E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平检测:术中CRC组织和癌旁组织于液氮中保存,迅速转移至-80 ℃冰箱保存,待测。按照Trizol试剂(上海酶联)操作步骤分离提取组织总RNA,按逆转录试剂盒(文韧生物)操作步骤逆转录合成cDNA,采用ABI 7500型qRT-PCR仪(美国ABI)检测组织中E2F2mRNA、EMR2mRNA相对表达水平,内参为β-actin,引物经设计软件设计后由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法计算相对表达量。

2.链霉菌抗生物素蛋白-过氧化氢酶连结法(SP法)检测CRC组织和癌旁组织E2F2、EMR2蛋白表达:CRC组织及相应癌旁正常组织进行5 μm连续切片,免疫组织化学试剂盒检测E2F2、EMR2蛋白表达。采用半定量方法,<3分阴性表达,≥3分阳性表达。

三、统计学分析

结果

1.CRC组织和癌旁组织E2F2、EMR2阳性率比较:与癌旁组织相比,CRC组织中E2F2、EMR2阳性率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,图1,图2。

图1 E2F2在CRC组织及癌旁组织中的表达(SP×200)

图2 EMR2在CRC组织及癌旁组织中的表达(SP×200)

2.CRC组织E2F2、EMR2表达与病人临床病理特征的关系:CRC组织E2F2、EMR2表达与病人TNM分期、淋巴结转移及浸润深度相关(P<0.05)。见表2。

表2 CRC组织E2F2、EMR2表达与病人临床病理特征的关系(例,%)

3.有无淋巴结转移病人CRC组织E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平:与无淋巴结转移病人相比,有淋巴结转移病人CRC组织中E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 CRC组织E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平

4.E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平对CRC病人淋巴结转移的诊断价值:将CRC病人有无淋巴结转移作为状态变量(1=有、0=无),将血清E2F2mRNA、EMR2mRNA水平作为检验变量,绘制ROC曲线(图3),结果发现,CRC组织中E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平单独及联合诊断淋巴结转移的AUC分别为0.782、0.844、0.877,E2F2mRNA联合EMR2mRNA诊断淋巴结转移的AUC高于二者分别单独诊断,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4,图3。

图3 E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平诊断CRC病人淋巴结转移的ROC曲线

表4 E2F2mRNA、EMR2mRNA表达水平对CRC病人淋巴结转移的诊断价值

讨论

CRC早期治愈率较高,当癌症转移到淋巴结或其他远处器官时,手术治疗CRC的效果变差,预后不理想[9]。研究表明,淋巴结转移是CRC病人预后的独立危险因素[10]。

E2F2通过激活ERK和AKT通路促进癌细胞增殖、细胞周期进程和运动性[4]。有证据表明,E2F2是重要的致癌因子,在多种肿瘤的进展中起着促进作用,如E2F2与卵巢癌的预后显著相关[4]。本研究结果显示,CRC组织中E2F2蛋白阳性率较癌旁组织高,与Fan等[5]研究结果一致,与Ma等[11]的结果有所区别,这种差异可能是癌症异质性引起的。提示E2F2表达可能与CRC的发生有关。CRC组织中E2F2阳性表达与病人淋巴结转移、TNM分期及浸润深度有关,提示E2F2蛋白阳性表达可能参与调控CRC的分期状态及淋巴结转移,在CRC病情进展中具有一定作用。本研究还发现,有淋巴结转移的CRC病人组织中E2F2 mRNA表达水平较无淋巴结转移病人显著升高,ROC曲线显示,E2F2 mRNA表达水平对诊断CRC病人淋巴结转移具有一定的价值。因此,E2F2有可能成为提示CRC发生发展的生物学标志物,但关于其与CRC病人预后的相关性仍需进一步研究。

研究表明,E2F2和EMR2在肺癌中存在正相关关系,二者是同一miRNA的靶基因[12]。EMR2已被证明介导细胞黏附、迁移和信号传导[13]。EMR2介导胶质瘤侵袭,其表达增加与胶质瘤病人生存不良之间显著关联,且EMR2阳性肿瘤具有更大的浸润和转移扩散能力[14]。本研究结果显示,CRC组织中EMR2阳性率明显升高,且EMR2与淋巴结转移、TNM分期及浸润深度相关,提示EMR2表达可能与CRC的发生有关,可能作为CRC淋巴结转移重要生物标志物。术后肿瘤复发转移的CRC病人体内肿瘤细胞再次呈现异常增殖,并向其他组织、器官侵袭转移,导致结直肠上皮组织及其他正常细胞破坏,刺激新生血管生成,而EMR2能够通过N-钙黏蛋白调节基质金属蛋白酶-9的表达来调节血管生成和内皮细胞的增殖、迁移和侵袭[1,15]。进一步分析结果显示,与无淋巴结转移CRC病人相较,EMR2 mRNA表达水平在有淋巴结转移的CRC病人组织中显著升高;ROC曲线提示,EMR2 mRNA表达水平诊断CRC病人淋巴结转移的AUC为0.844,提示以EMR2为评估CRC病人淋巴结转移与否的指标具有一定可行性。此外,本研究还显示,E2F2 mRNA和EMR2 mRNA联合诊断CRC病人淋巴结转移的AUC为0.877,高于二者单独诊断,提示同时检测E2F2、EMR2表达可能对评估CRC病人是否发生淋巴结转移效果更好。

综上所述,E2F2、EMR2与在CRC组织中阳性表达率高于癌旁组织,与病人TNM分期、淋巴结转移及浸润深度相关,二者联合对淋巴结转移具有一定诊断价值。但本研究纳入病例较少,关于E2F2、EMR2如何在CRC进展中发挥作用,后续将扩大样本量进一步开展研究。