翟 斌,韩 梅,蒙莉萍,张钰坤,姚炎燚

1.内蒙古自治区包头市第八医院检验科,内蒙古包头 014040;2.内蒙古迪安丰信医疗科技有限责任公司,内蒙古呼和浩特 010000;3.内蒙古自治区包头市第八医院院长办公室,内蒙古包头 014040

冠心病(CHD)是心血管疾病中最常见的一种类型,发病率和病死率逐年上升且已经超过大多数肿瘤性疾病。有研究表明,高脂血症、糖尿病、高血压和吸烟是CHD高发的危险因素,且随着年龄的增加,CHD发病率也显著提高[1]。当冠状动脉发生粥样硬化,会引起管腔狭窄或闭塞,造成心肌缺血、缺氧性损伤或坏死。CHD的发生是由不同因素所致,病因尚不完全清楚,目前较多研究表明,脂质代谢异常和激活的炎症反应在CHD中起关键作用[2-3]。近年来,许多研究发现,炎症因子参与和调控着CHD的发生、发展过程,临床检测指标,如同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素等已经成为诊断CHD的关键指标被广泛研究[4-5]。本研究旨在通过生物信息学分析技术从GEO数据库下载CHD基因表达芯片数据,对差异表达基因进行分析,揭示CHD发生中涉及的相关生物过程和参与的信号通路,了解生物标志物潜在的分子机制,结合临床检测指标综合分析并对相关基因进行验证,为CHD的诊断与预防提供新的思路。

1 材料与方法

1.1基因微阵列数据的获取 以“Coronary Heart Disease”为关键词在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)进行检索获得样本的基因表达芯片,下载GSE71226和GSE66360两个数据集。其中GSE71226包括3例CHD患者样本和3例健康对照样本;GSE66360包括21例CHD患者样本和22例健康对照样本的基因表达矩阵,实验平台均来自Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2方法

1.2.1原始数据预处理及差异表达基因的挖掘 下载原始数据,利用R语言对芯片数据进行差异表达分析(以P<0.05,|logFC|≥0.5为筛选条件)和聚类分析,获得差异表达基因。

1.2.2共有差异表达基因Venn分析 通过TBtools软件对两个数据集的共有差异表达基因进行分析,得到交叉表达基因Venn图及共有基因列表信息。

1.2.3基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 GO分析是高通量基因数据功能分析最常用的方法,研究目标基因在细胞组分、分子功能和生物过程3个层面的功能作用。KEGG分析包含了多种生物化学通路,可以更清楚地了解目标基因参与人体哪些通路。通过将待分析基因列表上传至DAVID生物信息学资源数据库,即可关联到基因相关功能注释和通路富集情况,将结果下载为文本文件,使用R语言(ggplot)对结果进行可视化处理。

1.2.4基因富集(GSEA)分析 GSEA分析对基因表达量矩阵进行计算,分析基因集合,可以更全面地分析基因的富集情况。下载两个数据集的基因表达原始数据并进行整理,使用GSEA线上软件(https://www.omicshare.com/tools/Home/)进行可视化分析,筛选条件为P<0.01,错误发现的比率(FDR)<25%。

1.2.5蛋白质互作网络(PPI)分析 PPI分析使用STRING(https://cn.string-db.org/)在线软件。将基因列表上传即可展示PPI分析结果,下载数据后通过Cytoscpe插件筛选Hub基因,并对PPI图进行可视化。采用GeneMINIA在线分析软件对Hub基因进行基因功能预测。

1.2.6临床指标检测 根据心血管病学分会介入心脏病学组制订的CHD诊断标准,选取包头市第八医院收治的CHD患者74例[平均年龄(57.53±5.37)岁]和健康体检者71例[平均年龄(52.44±8.43)岁]。排除标准:并发自身免疫性疾病和急/慢性感染性疾病;合并恶性肿瘤、肾功能不全和肝胆疾病;近1个月服用过糖皮质激素和免疫抑制剂。检测指标包括白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEUT#)、淋巴细胞计数(LYMPH#)、单核细胞计数(MONO#)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)、hs-CRP、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和Hcy。本研究获得包头市第八医院伦理委员会审批,所有研究对象知情并同意参与本研究。

1.2.7蛋白印记法(Western blot)检测大鼠Toll样受体(TLR)4、共济失调毛细血管扩张突变(ATM)蛋白表达 选取清洁级SD大鼠15只,体质量220～250 g。随机抽取9只每天给予高脂饲料连续喂养6周后,腹腔注射垂体后叶素30 μg/kg,连续3次,间隔24 h,建立CHD大鼠模型,选取建模成功的CHD模型6只,其余6只作为对照组。取大鼠心肌组织100 mg加入适量放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解液提取蛋白,使用试剂盒进行蛋白定量。将蛋白溶液与缓冲液进行混合并煮沸,短暂离心后根据目标蛋白相对分子质量配制不同浓度分离胶,设置电泳时间,电泳后的样本转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,按照顺序放置于转印夹低温转印150 min;取出PVDF用Tris缓冲液(TBS)清洗1 min,快速转移至一抗中,4 ℃孵育过夜,次日取出用加吐温20的TBS(TBST)清洗10 min,共3次,移入荧光二抗中避光孵育2 h,移出用TBST清洗10 min,共3次,随后进行X光显影检测。

2 结 果

2.1差异基因的筛选 为寻找CHD相关差异表达基因,进一步分析疾病发生中基因的相互作用,以P<0.05,|LogFC|≥0.5为筛选条件进行分析。GSE71226中共鉴定出3 348个差异基因,其中包括1 509个上调基因,1 839个下调基因;GSE66360共鉴定出2 820个差异基因,其中包括1 724个上调基因,1 096个下调基因。

2.2共有差异表达基因的Venn分析 为找到CHD患者具有显著差异的共表达基因,通过Venn分析将两个数据集的差异表达基因进行筛选,结果显示,两个数据集有458个共有差异表达基因,其中上调基因171个,下调基因287个。见图1。

注:A为上调基因;B为下调基因。

2.3GO和KEGG分析 为了解两个数据集中CHD患者共有差异表达基因的生物学功能,对458个共有差异表达基因进行了GO分析,结果显示,CHD中共有差异表达基因主要参与的生物学功能包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控和DNA模板化;所属的细胞成分主要包括细胞核、细胞质等;其分子功能主要为蛋白质结合、金属离子结合。KEGG分析显示,共有差异表达基因显著富集的信号通路包括单纯疱疹病毒Ⅰ型感染、破骨细胞分化、花生四烯酸代谢通路、核因子(NF)-κB信号通路等,表明这些基因主要参与一些病毒感染、炎症和免疫相关代谢通路。见表1。

表1 部分共有差异表达基因KEGG通路分析

2.4GSEA富集分析 为进一步分析CHD差异表达基因可能参与的信号通路,对两个数据集的基因表达谱进行GSEA分析,结果显示,两个数据集差异表达基因主要富集于Toll样受体信号通路、炎症反应、白细胞迁移和花生四烯酸代谢通路等,表明CHD中差异表达基因主要在炎症反应中富集,并表现为负反馈调节,与KEGG分析结果一致。

2.5PPI分析 为筛选CHD中的关键基因,对458个共有差异表达基因进行PPI分析,使用MCODE插件对PPI图进行聚类(node score cut-off =0.2,K-core=2),通过K-means聚类算法将得分排序,筛选出前两条基因簇。见图2。使用Cytohubba插件以MCC算法筛选出20个关键基因。上调基因包括细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)、白细胞介素1受体拮抗剂(IL1RN)、整合素αM(ITGAM)、CXC基序趋化因子受体1(CXCR1)、双特异性磷酸酶1(DUSP1)、Fc γ受体ⅡA(FCGR2A)、甲酰肽受体2(FPR2)、含7A的C型凝集素结构域(CLEC7A)、细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)等,下调基因包括前列腺素-过氧化内合酶2(PTGS2)、磷酸酶和张力素同系物(PTEN)、过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ(PPARA)、TLR8、TLR4、基质金属蛋白酶9(MMP9)、GATA结合蛋白3(GATA3)、ATM基因、维甲酸诱导基因Ⅰ(DDX58)、白细胞介素1受体Ⅱ型(IL1R2)、人抑瘤素M(OSM)等。这提示这些基因的异常表达可能与CHD的发生与发展有着密切关联。使用GeneMINIA软件对Hub基因互作关系进行分析,结果显示,TLR4、ATM基因和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因相互作用明显,表明其可能在CHD的发生中共同参与调控。

注:A为基因簇1(score:5.8);B为基因簇2(score:4.0)。

2.6临床检测指标结果 CHD患者MONO#、hs-CRP、TC、Hcy水平均明显高于健康对照者,LYMPH#、Hb水平均明显低于健康对照者,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CHD患者与健康对照者临床检测指标水平比较

2.7TLR4、ATM在CHD大鼠心肌组织中的表达水平 与健康大鼠心肌组织比较,CHD大鼠心肌组织TLR4、ATM蛋白表达水平显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TLR4、ATM在CHD大鼠心肌组织和健康大鼠心肌组织中蛋白表达水平比较

3 讨 论

我国心血管疾病的死亡人数仍在快速增长,患病人群以老年人为主,伴有并发症多和病死率高的风险。冠状动脉造影术不仅给患者带来痛苦,还要承担昂贵的医疗费用[6]。CHD发生机制复杂,尚无确切阐述,但已有大量实验证实,动脉粥样硬化与血管壁炎症及脂质代谢紊乱密切相关[3,7]。本研究通过生物信息学分析技术,筛选CHD差异表达基因,探究其发生、发展中参与的生物过程,结合临床检测指标综合分析,对核心基因进行验证,旨在为疾病的早期诊断提供思路。

NF-κB是细胞中对免疫与炎症进行调节的重要因子,具有促进炎性细胞因子活化、调节细胞增殖的作用[8]。TLR4是Toll样受体家族在炎症反应中一类高度保守的模式识别受体,其与特异性配体结合后通过激活一系列下游蛋白质级联反应将刺激信号传递到细胞核,激活免疫应答基因,如NF-κB,进而诱导与炎症反应相关的各种细胞因子和黏附分子的表达[9]。本研究临床指标中检测到Hcy、hs-CRP、TC水平在CHD患者中显著升高。C反应蛋白(CRP)是机体受到感染或组织损伤后血浆中急剧上升的一种急性蛋白质,是经典补体途径的激活剂[10]。PANG等[11]发现,Hcy通过刺激CRP来启动血管平滑肌细胞的炎症反应,而CRP通过NMDAr-ROS-ERK1/2/p38-NF-κB信号通路介导炎症反应、刺激内皮细胞表达黏附分子、抑制NO的产生而损伤内皮细胞,从而促进动脉粥样硬化的进展。血脂异常在CHD中起着关键作用,机体内TC水平过高也是导致动脉粥样硬化的重要因素。XIAO等[12]发现,TC水平也与TLR4/NF-κB通路的激活有关。

本研究在对Hub基因互作关系研究中发现,TLR4、ATM与MTHFR存在相互作用关系[13]。MTHFR基因是Hcy代谢的关键酶,其677位容易发生突变从而导致该酶活性降低,Hcy代谢能力受阻,导致体内Hcy水平升高[14]。同时,MTHFR基因可通过损伤患者内皮细胞使血管弹性降低,从而促进冠状动脉斑块形成[15]。ATM蛋白属于磷脂酰肌醇3-OH家族成员,是细胞管家基因,在DNA修复和细胞凋亡中起着至关重要的作用[16]。动脉粥样硬化常伴随氧化应激程度升高,其特征是血管壁中的脂质和蛋白质氧化,血管内皮细胞损伤。动脉粥样硬化发生的氧化应激和DNA损伤均已被证明能激活ATM基因[17-18]。本研究KEGG分析发现,ATM基因也参与了NF-κB信号通路的调控,通过调节细胞因子而发挥作用。氧化激活的ATM激酶具有促细胞增殖作用,通过磷酸化下游底物,参与多条相关通路以维持氧化还原稳态、调控代谢功能和增强信号通路[19]。本研究在CHD大鼠心肌组织Western blot实验中发现,TLR4和ATM蛋白在心肌组织中低表达(P<0.05),提示在CHD发生过程中这两个基因参与了调控,证实了本研究结果,因此,这两个基因有望成为CHD的候选标志物。

综上所述,CHD的发生与发展伴随着炎症反应和脂质代谢异常。TLR4、ATM参与的生物过程在动脉粥样硬化发生过程中起着重要作用,通过对CHD患者有显著差异表达的指标与差异表达基因参与的通路进行综合分析,了解CHD关键指标检测的重要性,为高危人群的筛查及诊断提供思路。本研究还具有一定的局限性:首先,样本量较小导致一些检测指标差异不明显;其次,针对核心基因的验证实验还不够完善。后续将通过更加完善的研究对CHD的发生机制进行探索,为疾病的诊断和预防提供更有意义的指导。