申杨磊,方龙伟,央 拉,多吉卓玛,巴桑卓玛

西藏大学高原健康科学研究中心,西藏拉萨 850000

高原红细胞增多症(HAPC)是高原地区常见的慢性高原病之一,其主要特征为红细胞过度增生,表现为血红蛋白浓度显著增加,其病变多呈慢性过程,后期常伴有全身多系统、器官、组织不同程度损害[1]。

根据世界卫生组织的分类,肺动脉高压(PH)可分为动脉型PH、左心疾病所致PH、肺脏疾病和(或)低氧所致PH、慢性血栓和(或)栓塞性PH、多种未明机制所致PH 5类[2]。其中高原肺动脉高压(HAPH)属于第3类,是由于高原低氧环境,肺换气代偿性增加、血细胞比容升高、血管收缩引起的一种慢性高原病[3],与HAPC一样,也是非常典型的危害高原人群健康的疾病,而且现有研究表明,HAPC与PH间存在共同的病理特征:(1)红细胞与血红蛋白增加;(2)肺泡壁明显增厚,纤维增粗,弥散功能下降;(3)肺动脉压力变化与红细胞过度增生有关。HAPC的主要表现为红细胞与血红蛋白异常增加,对PH的文献查阅结果同样发现红细胞与血红蛋白增加,而红细胞与血红蛋白异常增加可对机体心、肺、肾等脏器功能造成损伤。此外,还有学者通过研究过度表达人类促红细胞生成素(EPO)的转基因小鼠,分析小鼠血液中红细胞增生情况与肺动脉压力的变化,发现PH的发生与红细胞过度增生有直接关系[4-5]。有学者研究发现,HAPC患者肺泡壁明显增厚和纤维增粗,使肺泡间质弥散功能下降,红细胞的过度增加使肺动脉压力明显升高[6-8]。以上相关研究均表明HAPC与PH间具有相同的发病特征。但目前检索到的HAPC与PH两种疾病间的相关性研究较少,因此利用生物信息学工具对两种疾病的相关数据进行检索,筛选出共同的差异基因和信号通路,但因目前数据库中关于HAPH相关基因的数据太少,本文就HAPC与PH的基因差异进行比较和分析,旨在为进一步探讨HAPC与PH之间发病机制的异同及关联提供理论依据。

1 材料与方法

1.1数据来源 使用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)对以人类为研究样本的HAPC与PH基因数据进行检索,获取GSE29977[9]、GSE53408[10]、GSE703[11]、GSE113439[12]4个数据集,对其研究选择的样本与研究方法进行筛选、排除后保留GSE29977与GSE53408数据集。GSE29977芯片属于GPL570平台[(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]基因芯片,共包括10个样本,其中5例HAPC患者、5例健康对照者;GSE53408芯片属于GPL6244平台[(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0ST Array transcript(gene)version]基因芯片,共包括23例样本,其中12例PH患者与11例健康对照者。

1.2差异基因筛选 通过R语言对数据集进行均一化处理后,使用Limma包[13]对数据中的差异基因进行筛选,然后在筛选结果基础上使用Bonferroni法对P值进行校正,GSE29977数据集校正后P值应<0.01;GSE53408数据集校正后P值应<0.004 54;差异基因的筛选标准应满足校正后P值且满足log2|FC|>1。得到两个数据集中符合标准的差异基因,再绘制韦恩图进行重叠筛选,得到两个数据集中共同的差异基因。

1.3基因本体(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析、基因富集(GSEA)分析 DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)是具有多种生物数据和分析工具的软件,可对目的数据进行富集分析,并提供注释信息。本研究通过DAVID数据库对筛选得到的共同差异基因进行GO分析、KEGG富集分析和功能注释,筛选条件为P<0.05。GO分析结果由3个部分构成:生物学过程(BP)、分子功能(MF)及细胞成分(CC)。GSEA分析是将所有基因纳入研究再筛选出差异显著的富集通路,筛选条件为P<0.05。

1.4GeneCards分析 GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)包括了多种生物的基因数据和大量疾病相关基因,该数据库对相关基因进行细致的分类,可以查阅到基因分布的组织、作用途径和与疾病相关度的得分。故利用GeneCards数据库对筛选到的差异基因进行检索,观察差异基因是否与相关疾病的致病基因相符、在人体组织中的分布是否与疾病相关。

2 结 果

2.1HAPC与PH基因筛选 GSE29977数据集标准化后进行富集分析,对富集出的差异基因进行筛选,得到1 627个差异基因(815个上调基因,812个下调基因),校正后符合筛选阈值(P<0.01;log2|FC|>1)的基因有396个,其中188个上调基因和208个下调基因。GSE53408数据集标准化后进行富集分析,筛选得到3 455个基因(695个上调基因,2 760个下调基因),校正后符合筛选阈值(P<0.004 54;log2|FC|>1)的基因有791个,其中695个上调基因和96个下调基因。将两个数据集转换为一致的基因ID并排除其中无名称基因,对剩余基因使用维恩图进行重叠筛选,共得到138个共同差异基因,校正后共同的差异基因有11个,分别为内皮细胞黏附分子(ESAM)、成纤维细胞生长因子18(FGF18)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类人类白细胞抗原DQB1(HLA-DQB1)、同源异构体A7(HOXA7)、POZ/BTB和AT结合基序锌指蛋白1(PATZ1)、整合素亚基B4(ITGB4)、甲基硫核糖-1-磷酸异构酶(MRI1)、基质金属肽酶8(MMP8)、Caspase12、10号染色体开放阅读框25(C10orf25)、H因子(CFH)。

2.2GO分析及KEGG分析 对138个差异基因进行功能注释,然后进行GO分析以及KEGG分析。校正前,BP差异基因主要富集在:中胚层形态生成、初级胚层形成、原肠胚形成;CC差异基因主要富集在:黏附连接、细胞与细胞连接、蛋白酶体调控颗粒碱基亚复合物、间质矩阵、宿主细胞内部分等;MF差异基因主要富集在:激活转录因子、MHCⅡ类受体活性、UDP葡萄糖基转移酶活性、腺苷脱氨酶活性、磷酸酪氨酸残基结合等。KEGG分析提示差异基因主要富集在:内质网蛋白质加工、细胞外基质(ECM)受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等。

先对校正后的11个差异基因进行功能注释,然后进行GO分析及KEGG分析。BP差异基因主要富集在初级胚层形成、原肠胚层形成,CC差异基因主要富集在MHCⅡ类蛋白复合物、复杂炎性体、核膜,MF差异基因主要富集在MHCⅡ类受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路、胰岛素样生长因子Ⅰ结合等。KEGG分析提示差异基因主要富集在金黄色葡萄球菌感染、细胞黏附分子、肌动蛋白细胞骨架的调节。见图1～4。

图1 校正前差异基因GO分析结果

图2 校正后差异基因GO分析结果

图3 校正前差异基因 KEGG分析结果

图4 校正后差异基因KEGG分析结果

2.3GSEA分析 由于得到的数据集差异基因较少,进一步使用GSEA分析对差异基因附近的通路进行分析,探索HAPC与PH的共同性。GSE53408数据集的GSEA分析结果显示只有两个通路具有显著差异。细胞周期信号通路具有最高标准化富集得分[NES,NES=2.236 2,P<0.000 1,错误发现的比率(FDR)<0.014],其次为卵母细胞减数分裂通路(NES=2.014 0,P<0.001 2,FDR<0.027)。GSE29977数据集的GSEA分析结果并未发现两种疾病间共同的信号通路,需要在未来进行进一步研究分析。见表1。

表1 GSEA分析筛选GSE29977数据集差异富集的信号通路

2.4GeneCards分析 通过GeneCards网站对筛选出的138个共同差异基因和校正后得到的11个差异基因数据进行分析。对未校正前筛选到的131个(有7个基因数据库未能识别)共同差异基因检索结果显示,差异基因在人体多个组织均有表达,由于PH属于心血管系统疾病(或循环系统疾病),故对心血管系统疾病的分类进行检索分析,结果显示与这131个共同差异基因相关的疾病中包含PH。对筛选到的138个差异基因与人类PH所有相关基因进行比对,结果显示相同的基因有60个,与PH高度相关的基因有血管紧张素转换酶(ACE)、微小RNA、SMAD通路蛋白(SMAD)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)。

对校正后的11个差异基因进行对比,显示有5个相同基因:FGF18、HLA-DQB1、PATZ1、MMP8、CFH。结果在疾病分类中未查阅到PH。对校正后11个差异基因进行检索,结果显示其中4个基因在肺部高表达,包括ESAM、FGF18、HLA-DQB1、PATZ1。PATZ1主要表达于肺茎支气管中;ESAM表达于肺血管内皮细胞表面;HLA-DQB1表达在肺、血液、呼吸道上皮细胞表面、支气管中部。对相关疾病的分析结果显示,高血压分类与PH相关性评分较高(相关性得分为34.1),故推测HAPC与PH间可能存在相关性。

3 讨 论

通过知网和Pubmed两个数据库对本次筛选出的相关基因进行检索,发现与本次筛选结果相同的基因有ACE、PDGF、HLA-DQB1。研究表明,ACE是肾素-血管紧张素系统产生,具有强烈的血管收缩作用。机体在低氧环境下促使ACE产生且受低氧诱导因子(HIF)调控,傅薇[14]研究表明HAPC患者骨髓单个核细胞、骨髓液、血液及骨髓的ACE水平均增高,证明ACE是HAPC的发生机制之一,同时ACE的同素体ACE2广泛分布在心、肾、肺等器官,在肺中分布于Ⅰ型肺泡上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、巨噬细胞、肺血管内皮细胞、平滑肌细胞。相关研究表明ACE可以促进血管紧张素2(AngⅡ)产生,AngⅡ可以诱发肺血管内平滑肌细胞迁移,刺激炎症因子、转化生长因子-β(TGF-β)产生,诱导肺实质细胞凋亡,AngⅡ还可进一步促进血管收缩及平滑肌细胞生长迁移,加重PH发生[15]。查阅现有PDGF相关研究结果显示,PDGF家族包括PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD等。PDGF具有趋化、收缩血管、促进分裂作用,参与磷酸酯酶激活与前列腺素代谢。殷玉娟等[16]研究显示,HAPC患者血小板活化,PDGF表达升高,血栓形成使得血液成分和血流状态改变[17],可以使HAPC患者血氧饱和度下降10%[18],加重血管细胞损伤,促使血栓形成增加,故PDGF是HAPC的发病原因之一。彭虹艳[19]研究发现,PDGF可以在有氧环境下促进主动脉血管平滑肌细胞糖酵解增强,PDGF通过PI3K/AKT/mTOR信号通路上调HIF-1α,使得丙酮酸脱氢酶(PDH)磷酸化活性下降,产生肺动脉平滑肌Warburg效应,使得肺动脉平滑肌异常增殖、肺动脉重构,证明PDGF在PH的发生过程中发挥重要作用。检索现有与人类白细胞抗原系统(HLA)相关文献,结果显示其具有高度基因多态性,其中DQA1和DQB1具有多种免疫学功能,且已有研究表明HLA除与免疫系统疾病相关外,还与呼吸系统、消化系统、心血管系统疾病存在相关性[20]。青格乐图等[21]对青海地区HAPC患者人类白细胞抗原DQA1(HLA-DQA1)和HLA-DQB1的6个等位基因与健康对照者进行对比,结果发现HLA-DQB1与肺动脉高压的发生密切相关[22]。通过对已有文献进行查阅,与本次分析筛选到的差异基因进行对比,结果显示有多个已验证的疾病相关基因,其余未验证的差异基因需在未来进行实验验证。

本研究还存在以下不足:(1)在GEO数据库中检索到的研究样本较少;(2)GeneCards在线数据库分析结果与目前已有的基因研究结果相符的数据较少;(3)GSEA分析结果未发现共同的信号通路,需进一步进行分析研究;(4)本研究仅是对GEO数据库中已有的相关研究数据进行分析研究,需要进行实验验证。

综上所述,本研究为HAPC与PH的相关研究提供了思路和研究方向,下一步可对筛选的差异基因进一步分析,并进行功能验证进而探索不同的PH类型与HAPC的相关性。