高松林，韦柳婷，覃雁，吴美玲，黄萱，黄贵华（. 广西中医药大学，广西 南宁 530000；. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530000）

功能性便秘（functional constipation）是一种常见的以排便次数减少、排便困难为特点的功能性胃肠道疾病[1]。功能性便秘的诊断多依照罗马标准，按照罗马Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准诊断的全球成人患病率分别为11.2%、10.4%和10.1%[2]；我国成人患病率分别为10.6%、6.5%和8.1%，女性患病率高于男性[3]。功能性便秘的病因尚不清楚，其发病机制与结、直肠动力及盆底肌功能、脑肠轴、肠道菌群、黏膜免疫功能改变等相关[4-8]。

现代医学治疗功能性便秘的主要方法是生活方式干预、药物疗法、生物反馈疗法和手术治疗等，具有良好的短期疗效，但缺乏长期有效性和安全性[9-10]。

中医治疗功能性便秘注重整体观念和辨证论治，疗效确切，具有远期疗效佳、安全性强等优势[11-12]。中药复方专利源于长期反复的临床实践，具有较好的疗效和可重复性，为新药研发的重要来源。

本研究整合数据挖掘、网络药理学和分子对接方法探讨国家专利复方防治功能性便秘的用药规律和作用机制，以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源 登录国家知识产权局的中国专利公布公告网（http://epub.cnipa.gov.cn/），在高级查询界面中同时选择“发明授权”及“发明公布”选项，在“文本-名称”或“文本-摘要/简要说明”项目中输入“功能性便秘”“慢传输型便秘”分别进行检索。检索时间范围为建库至2022 年9 月3 日。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：专利名称或摘要或简要说明中，明确指出用于功能性便秘的中药复方专利。

1.2.2 排除标准：①用法为外用的专利（包括贴剂、熨烫剂、精油、灌肠等）；②专利处方中组成不明确且在中国知网专利数据库下载全文后仍不能补充完整者；③食品、饮品、保健品类专利；④只有单味中药的专利处方。

1.3 数据统一及录入 参照《中药学》[13]对药名规范处理，未收录的中药则参考2020 年版《中华人民共和国药典》[14]，若在二者中均未收录则保留原名。如元参、麻仁、附片、鸡屎藤、生地、熟地分别规范为玄参、火麻仁、附子、鸡矢藤、生地黄、熟地黄；炒枳实、焦神曲分别规范为枳实、六神曲。双人双机分别在Excel 表中录入和校对处方数据，组成相同的专利仅录入1 次。将整理后的Excel 表导入中医传承计算平台V3.0（TCMICS V3.0）进行数据挖掘。

1.4 数据分析 使用“TCMICS V3.0”平台，在“方剂分析”模块中选择药物频数、关联规则、聚类分析等功能对复方专利中药物的频数、组方规律等进行分析，运用Excel 表分析高频药物的性味归经和功效。

1.5 网络药理学分析 基于TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 为条件筛选出核心高频药物组的活性成分和作用靶点，借助Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/），以Status 设为Reviewed、Popular organisms 设 为Human” 对 靶 点 进 行 规 范。 在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank数 据 库（https://go.drugbank.com/）中 以“functional constipation”作为关键词执行检索，合并去重后获得功能性便秘的相关靶点。利用R 软件进行Venn 分析获取核心高频药组与功能性便秘的交集靶点，采用Cytoscape 3.8.0 构建中药-活性成分-靶点网络并筛选关键活性成分。将交集靶点上传至STRING 数据库（https://string-db.org/），设定生物种类为“Homo sapiens”， 最小互相作用阈值设定为“highest confidence”（＞0.95），隐藏游离的靶点，构建蛋白互作（PPI）网络模型，通过Cytoscape 3.8.0 对PPI 网络进行分析。使用R 软件对交集靶点进行富集分析。通过PubChem 数据库、PDB 数据库下载核心活性成分、关键靶点的结构，结合Chem3D 软件、PyMol软件、AutoDockTools 1.5.6 软件进行预处理，运用AutoDockVina 1.1.2 软件进行分子对接。

2 结果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 专利复方检索结果 初步检索共获得专利279 项，由于“文本-名称”项目检索出来的结果大部分都存在于“文本-摘要/简要说明”项目检索的结果中，故重复的复方专利较多，经去重、筛选后共纳入专利72 项。72 项复方专利的申请公布日或授权公告日为1998 年9 月30 日—2022 年8 月30 日。

2.1.2 高频药物频数分析 见表1。72 项复方专利共涉及262 种中药，总频数达691 次，每项复方专利的中药味数在2～40 味之间。高频药物有白术（26 次，36.11%）、甘草（24 次，33.33%）、肉苁蓉（20 次，27.78%）、枳实（19 次，26.39%）、当归（19 次，26.39%）、火麻仁（18 次，25.00%）等20 味。

表1 防治功能性便秘专利中药复方的高频药物统计（频数≥10 次）Table 1 High-frequency statistics of patented Chinese herbal compounds for the treatment of functional constipation（frequency ≥10）

2.1.3 高频药物功效分析 见表2。对20 味高频中药进行功效分类统计，发现补虚药最多，其次是理气药和清热药，随后依次是泻下药、化湿药和活血化瘀药。

表2 治疗功能性便秘专利中药复方的药物功效频数统计（频数≥11 次）Table 2 Frequency statistics of the drug efficacy of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation（frequency ≥11）

2.1.4 高频药物药性分析 见图1。对高频中药进行四气、五味、归经分析，结果表明四气以温（114 次）、微寒（67 次）、平（63 次）、寒（36 次）、微温（14 次）为主，无凉性药；五味以甘（179 次）、苦（177 次）、辛（112 次）、酸（44 次）、咸（31 次），微苦（12 次）为主，无淡味、涩味药。归经以脾（204 次）、胃（172 次）为主，肺（98 次）和大肠（98 次）次之。

图1 治疗功能性便秘专利复方中药高频药物的四气（A）、五味（B）和归经（C）统计（频数/次）Figure 1 Statistics of medicinal properties（A），flavours（B）and meridian tropism（C）of high-frequency drugs（frequency/time）of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

2.1.5 基于关联规则的组方规律分析 当设置支持个数=9（支持度12.5%），置信度=0.9 时，置信度可以用来衡量关联规则的可信程度的大小，获得8 个常用药物组合，见表3。核心组方为白术、当归、肉苁蓉、黄芪、甘草、厚朴、枳实，网络展示见图2。当置信度≥0.7 时，结果显示多种药物关联规则，见表4。

图2 治疗功能性便秘专利中药复方的核心药物关系网络Figure 2 The relationship network of core drugs of patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

表3 治疗功能性便秘专利中药复方中高频药物组合Table 3 Combinations of high-frequency drugs in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

表4 治疗功能性便秘专利中药复方中药物的关联规则（置信度≥0.7）Table 4 Association rules of drug in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation（confidence ≥0.7）

2.1.6 聚类分析 见图3、表5。设置聚类个数为4，将72 首专利复方聚类为4 类。

图3 治疗功能性便秘专利中药复方方剂聚类分析图Figure 3 Diagram of the cluster analysis of the patented Chinese herbal compounds

表5 治疗功能性便秘专利中药复方中的药物聚类分析Table 5 Cluster analysis of drug in the patented Chinese herbal compounds in the treatment of functional constipation

2.2 网络药理学分析结果

2.2.1 核心高频药物组相关靶点筛选 见表6。经筛选、去重后共获取到核心高频药物组（白术-当归-肉苁蓉）的14 个活性成分和190 个潜在靶点，规范化后最终得到潜在靶点163 个，涉及活性成分11 种。

2.2.2 核心高频药物组治疗功能性便秘的潜在作用靶点预测 见图4。将从4 个数据库获取的功能性便秘靶点整理去重后最终得到5 514 个，其中133 个靶点为核心高频药物组和功能性便秘的交集靶点。

图4 核心高频药物组（白术-当归-肉苁蓉）-功能性便秘靶点的韦恩图Figure 4 Venn diagram of core high-frequency drug combination（Cistanches Herba-Angelicae Sinensis Radix-Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）-functional constipation targets

2.2.3 中药-活性成分-靶点网络的构建 使用Cytoscape 3.8.0 软件对133 个交集靶点进行中药-活性成分-靶点图的构建（图5）并筛选出度值靠前的5 位活性成分（表7）。

图5 高频药物组治疗功能性便秘的“中药-活性成分-靶点”网络图Figure 5 Network diagram of “TCM-active comprnents-targets”of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

表7 度值排前5 位的活性成分Table 7 Active components with the top 5 of the degree value

2.2.4 核心高频药物组防治功能性便秘潜在靶点PPI网络的构建 将交集靶点传至STRING 数据库得到PPI 网络图（图6），通过Cytoscape 3.8.0 软件分析DC、BC、EC、CC、NC 和LAC 拓扑参数，以6 个数值均大于其中位数的节点为条件，进行2 次筛选，得到蛋白激酶B1（AKT1）、热休克蛋白90AA1（HSP90AA1）、 MYC、 缺 氧 诱 导 因 子1 亚 基α（HIF1A）、肿瘤抑制因子P53（TP53）和细胞周期蛋白1（CCND1）等6 个核心靶点（图7）。

图6 核心高频药物组防治功能性便秘潜在靶点的PPI 网络模型Figure 6 Network model of PPI of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

图7 核心高频药物组防治功能性便秘潜在靶点的PPI 网络拓扑分析核心基因Figure 7 Topological analysis of core genes in PPI networks of high frequency drug combination for the treatment of functional constipation

2.2.5 交集靶点的通路富集分析 GO 富集分析得到2 181 个生物过程（BP）条目，主要包括对药物反应、活性氧代谢过程、对化学压力的反应等；72 个细胞组成（CC）条目，主要在膜筏、突触后膜、突触前膜等处发挥作用；172 个分子功能（MF）条目，主要富集在DNA-结合转录因子结合、核受体活性、配体-激活转录因子活性等，KEGG 富集分析得到磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、糖基化终产物（AGE）/糖基化终产物受体（RAGE）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-17、缺氧诱导因子（HIF）-1 等172 条通路。对排位靠前的条目进行绘图，见图8 和图9。

图8 核心高频药物组-功能性便秘的GO 基因功能富集分析（前10 位）Figure 8 GO enrichment analysis of the targets of the core highfrequency drug combination-functional constipation（top 10）

图9 核心高频药物组-功能性便秘的KEGG 通路分析（前30 位）Figure 9 KEGG enrichment analysis of the core high-frequency drug combination-functional constipation（top 30）

2.2.6 核心化学成分与关键靶点的分子对接 将度值排前3 位的活性成分与“2.2.4”项下的核心靶点进行分子对接，结果显示二者对接的最低结合能均≤-5 kcal·mol-1，可见结合活性较强[15]。并以功能性便秘临床常用药物莫沙必利（Mosapride）作为阳性对照药物，对接结果见表8。槲皮素-HIF1A 和槲皮素-CCND1 的结合活性最强，PyMol 软件展示见图10。

图10 部分活性成分和关键靶点分子对接图Figure 10 Molecular docking diagram of some active components and key targets

表8 分子对接结果Table 8 Molecular docking results

3 讨论

3.1 从高频用药、性味归经和功效统计方面分析用药规律 在治疗功能性便秘的72 个复方专利处方中，高频药物有白术、甘草、肉苁蓉、枳实、当归、火麻仁等20 味中药，以补虚、理气、清热、泻下、化湿、活血化瘀功效为主，这与便秘患者气血阴阳亏虚、气滞、热结、湿阻、血瘀病机的认识一致[16-21]。白术在专利复方中出现的频率最高，为健脾补气要药，其水溶性成分可以通过促进胃肠动力达到通便的效果[22-23]。肉苁蓉的有效成分总寡糖能够明显升高5-羟色胺、血管活性肠肽、神经降压素，降低水通道蛋白3（AQP3），润畅通便效果较好[24]。枳实可以通过增加Cajal 间质细胞（ICC）中X 连锁凋亡抑制蛋白、增殖细胞核抗原蛋白的表达促进ICC 的增殖，改善肠道运动功能障碍[25]。当归有助于结肠黏膜萎缩的恢复，促进黏液分泌，增加粪便含水量，缓解便秘[26]。火麻仁油能调节肠内短链脂肪酸（SCFAs）水平和肠道菌群改善便秘[27]。高频药物性味归经显示性温，味苦、甘、辛，归属脾、胃、肺、大肠四经的药物最多。温药具有温中散寒、温阳通脉、温阳化气等作用，既能散寒凝、血瘀之标实，又能温阳助运以治其本。苦能泄，清泄火热，泄降肺胃之气逆，令气机调达，肠腑畅通。甘能补、能和，补益气血津液，恢复肠道濡养状态。辛味能散能行，能开腠理、行气滞、布津液发挥润燥的作用，亦有“辛润法”之称[28]。

3.2 从关联规则分析药物配伍规律 关联规则结果数值越大，说明其相关性高。综合药物频次、支持度和置信度排位发现核心高频药物组是白术-肉苁蓉-当归。白术归脾胃经，善于益气健脾、燥湿利水，肉苁蓉归肾、大肠经，善于补肾阳、益精血，当归归肝、心、脾经，为血中圣药，善于补血活血、润肠通便，三者配伍以补益为主，气血互用，寓通于补，兼水湿、血瘀同治。核心组方包括白术、当归、肉苁蓉、黄芪、甘草、厚朴、枳实7 味药物，可看做是枳术丸、当归补血汤、小承气汤、济川煎等方剂的加减，临床疗效较佳[29-30]。其中关于枳术丸治疗便秘的机制研究最多，其可能通过激活磷脂酶C-γ 信号通路、PI3K/AKT 信号、提高血清钙离子的浓度、调节胃肠激素水平等促进胃肠运动[31-34]。

3.3 从药物聚类分析处方核心组合 从聚类分析来看，可分为四类。第一类：菊花、决明子、马齿苋、枸杞子、金银花、甘草，以清热解毒，润肠通便为主。第二类：火麻仁、白芍、肉苁蓉、甘草、白术、决明子，以芍药甘草汤为基础加减，酸甘化阴，滋养脾阴，白术益气健脾，火麻仁、肉苁蓉、决明子润肠通便，以益气养阴，润肠通便为主。第三类：甘草、当归、枳壳、肉苁蓉、党参、白术，可看做为四君子汤加减，以健脾助运，润肠通便为主，兼行气导滞。第四类：枳实、白术、玄参、麦冬、生地黄、甘草，为增液汤合枳术丸加减，既可行增水行舟使水满舟行，又可健脾消痞使“四季脾旺不受邪”，以滋阴润肠、运脾通便为主。

3.4 运用网络药理学分析核心高频药组可能的作用机制 基于数据挖掘研究结果，发现白术、肉苁蓉、当归是防治功能性便秘的高频药物，三药不仅作为常用药物组合出现，而且也在核心药物关系网络和聚类分析中列出，可见其为核心高频药组。白术-肉苁蓉-当归治疗功能性便秘的主要活性成分可能为槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等。槲皮素能通过调节毒蕈碱乙酰胆碱受体下游信号、增加ICC 标志物（酪氨酸激酶受体和干细胞因子）以及降低AQP3 的水平缓解洛哌丁胺诱导的大鼠便秘[35-36]。β-谷甾醇具有改变小鼠肠道菌群结构并将其恢复到接近正常水平的潜力[37]。豆甾醇可能通过调节肠道菌群及其代谢物SCFAs 来恢复辅助性调节性T 细胞/T 细胞17（Treg/Th17）平衡以改善肠道炎症[38]。

白术-肉苁蓉-当归治疗功能性便秘的核心靶点有AKT1、HSP90AA1、MYC、HIF1A、TP53 和CCND1等。AKT1 是AKT 的一个亚型，通过调节AKT/核因子（NF）-κB 信号通路能够促进慢传输型便秘（STC）小鼠排便、改善肠道流动性和增强ICC 增殖[39]。HSP90AA1 可以诱导结直肠癌细胞系的增殖、迁移和凋亡[40]。抑制c-Myc 介导的干扰素基因刺激因子活性，可以降低血清γ-干扰素（IFN-γ）和TNF-α 等炎性细胞因子的表达[41]。TNF-α 在小鼠结肠黏膜和肌层炎症中发挥重要作用，并且TNF-α 可以通过作用于平滑肌直接诱导运动功能障碍[42]。HIF-1α 与肠道屏障的完整性和炎症因子的转录调控有关[43]。IFN-γ以时间和剂量依赖性方式作用于NF-κB 通路提高HIF-1α 的表达，引发肠道屏障功能障碍和紧密连接蛋白破坏[44]。Tp53 通过唾液酸代谢在维持肠道微生物群共生和免疫稳态中发挥着关键作用，其突变导致的唾液酸代谢失调可能会引发肠道微生态失调导致慢性炎症[45]。CCND1 可以调节细胞周期从G1 期到S 期的进程，位于苏氨酸286 的突变体在调节炎症和肿瘤发展中具有关键作用[46]。

KEGG 富集分析得到PI3K/Akt、AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1 等信号通路。洛哌丁胺诱导的SD 大鼠便秘与补体C3 及其受体下游PI3K/AKT、RAS 同源基因家族成员A（RhoA）/肌球蛋白轻链（MLC）、MAPK 信号通路的上调密切相关[47]。有研究[48]发现抑制PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路可以促进谷氨酸诱导的ICC 的凋亡、自噬和焦亡治疗STC。有学者[49]认为AGE-RAGE 信号通路与肠道通透性有关，RAGE 可作为肠道屏障完整性的调节剂。AGE 和RAGE 水平升高可能导致糖尿病胃肠道功能障碍[50]。使用蛋白质印迹法和聚合酶链反应测量STC 诱导的大鼠肠组织中MAPK 和细胞外调节蛋白激酶（ERK）表达，发现二者显著升高[51]。阻断MAPK/ERK 通路信号能够改善胃肠动力障碍治疗便秘[52]。IL-17A 通过上调肌层巨噬细胞中的一氧化氮合酶表达诱导肠道运动障碍[53]。

综上所述，在治疗功能性便秘的国家专利复方中，白术、甘草、肉苁蓉、枳实、当归等为高频药物，药物功效以补虚药、理气药、清热药、泻下药、化湿药和活血化瘀药为主，性味以甘温为主，主归脾、胃、肺和大肠经。最常用的药对为肉苁蓉-当归，核心高频药组是肉苁蓉-当归-白术，核心处方组成为白术、当归、肉苁蓉、黄芪、甘草、厚朴、枳实。核心高频药组肉苁蓉-当归-白术可能通过槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分，调节AKT1、HSP90AA1、MYC、HIF1A、TP53 和CCND1等核心靶点，调控PI3K/Akt、AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17、HIF-1 等信号通路发挥恢复肠道动力、调节肠道菌群、抑制炎症反应等作用治疗功能性便秘。本研究基于中国专利数据库、数据挖掘、网络药理学和分子对接方法挖掘防治功能性便秘的国家专利复方的潜在用药规律及作用机制，后续仍需结合临床实践，进行相应的实验研究和临床验证，为其临床有效防治功能性便秘提供更准确的证据。