郑雪霞，钱凯，韩玉凤，刘小宝，许舒迪，钟晓琴，刘敏莹，林昌松（. 广州中医药大学，广东广州 50405；.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 50405）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的风湿免疫疾病，其主要病理特征为持续性的滑膜炎和血管翳形成，导致滑膜增生、骨及软骨的破坏[1-2]。血管翳中的新生血管可能是维持和促进类风湿关节炎发展的核心因素[3]。越来越多的证据表明，缺氧和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在RA 血管生成的病理进程中起关键作用[4]。血管内皮生长因子α（VEGF-α）是HIF-1α 关键的下游效应分子[5]，能够促使内皮细胞活化、增殖与迁移，从而形成新生血管[6]。因此，阻断HIF-1α/VEGF-α 信号通路的激活，可能改善RA 病理性血管新生。

南续益母方为本课题组林昌松教授的经验方，对RA 和骨关节炎等风湿疾病具有较好疗效，已被开发为广州中医药大学第一附属医院院内制剂南续益母颗粒（粤药制备字Z20200139000），广泛应用于临床。本课题组前期研究[7]发现，南续益母方的潜在有效成分β-谷甾醇能通过VEGF 信号通路减少胶原诱导型关节炎（CIA）小鼠滑膜血管生成，从而减轻小鼠关节肿胀和骨破坏。网络药理学分析[8]显示，南续益母方可能通过HIF-1 信号通路发挥对RA 的治疗作用。但南续益母方对RA 动物及细胞模型的作用及机制仍有待深入探索。因此本研究拟建立CIA 小鼠模型，基于HIF-1α/VEGF-α 信号通路探讨南续益母颗粒对其滑膜血管翳生成的作用及可能机制，以期为南续益母颗粒治疗RA 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物 DBA/1 雄性小鼠40 只，SPF 级，7～8 周龄，体质量（18±2）g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，动物质量合格证号：110322210100842268。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院实验动物中心SPF 级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2018-0092。本实验经过广州中医药大学第一附属医院伦理委员会审核批准，伦理批文号：TCMF1-2021018。

1.2 药物及试剂 南续益母颗粒（批号：20210101），广州中医药大学第一附属医院；注射用甲氨蝶呤（Methotrexate，批号：02191103），山西普瑞药业有限公司。牛Ⅱ型胶原（批号：20022）、完全弗氏佐剂（批号：7001）及不完全弗氏佐剂（批号：7002），均购自美国Chondrex 公司；番红O 染液（批号：S8884）、固绿染液（批号：F7252），均购自美国Sigma 公司；HE 染液（批号：SBJ-0446），南京森贝伽生物科技有限公司；缺氧诱导因子1α（HIF-1α）抗体（批号：AF6191）、血小板-内皮细胞黏附分子1（CD31）抗体（批号：AF1009）、血管内皮生长因子α（VEGF-α）抗体（批号：AF5131），均购自江苏亲科生物研究中心有限公司；山羊抗兔二抗（批号：111-035-003），美国Jackson Immuno Research 公司；C-反应蛋白（CRP）测定试剂盒（批号：21110676M1）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（批号：21100363-1）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒（批号：21090881-1）、尿素氮（BUN）测定试剂盒（批号：20210800048-1）、肌酐（CR）测定试剂盒（批号：21101021M1）、类风湿因子（RF）测定试剂盒（批号：21101027M1），均购自桂林优利特医疗电子有限公司。

1.3 主要仪器 JJ-12J 型脱水机、JB-P5 型包埋机、JB-L5 冻台、RM2016 型病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；KD-P 型组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；DHG-9140A 型烤箱，上海慧泰仪器制造有限公司；MilliQAcademic 型超纯水系统，美国Millipore 公司； URIT-8021A 型全自动生化分析仪，桂林优利特医疗电子有限公司；Neofuge 18R型台式高速冷冻离心机，力新仪器上海有限公司；Skyscan1172 型高分辨率微型计算机断层摄影术（Micro- CT）扫 描 仪， 比 利 时 Bruker 公 司；Pannoramic MIDI 型数字病理切片扫描系统，匈牙利3D HISTEC 公司。

1.4 分组、模型复制及给药 小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4 组：正常组、模型组、甲氨蝶呤组、南续益母颗粒组，每组10 只。按照课题组前期方法制备胶原及佐剂的乳化剂，除正常组外，采用二次免疫法复制CIA 小鼠模型[9]。初次免疫时间记录为第0 天，二次免疫时间为第21 天，于第22 天开始给予相应药物灌胃，小鼠灌胃体积为10 μL·g-1。南续益母颗粒组给药剂量为12.33 g·kg-1（相当于临床等效剂量的12 倍），每天灌胃1 次，连续30 d；甲氨蝶呤组给药剂量为1 mg·kg-1，每3 d 灌胃1 次，其余时间点以等体积生理盐水灌胃，连续30 d；正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃，每天1 次，连续30 d。

1.5 小鼠关节炎指数（Arthritis Index，AI）评分 于二次免疫后每3 d 观察记录小鼠足肿胀情况，并进行AI 评分。采用4 分制的评分标准[10]，每只小鼠最高分为16 分，以AI 评分＞4 分为造模成功评判标准。

1.6 血清生化指标检测 给药30 d 后，采用异氟烷吸入麻醉小鼠，摘眼球取血；在4 ℃下静置1 h 后，以4 ℃、1 000 r·min-1（离心半径18 cm）离心20 min，分离上清，分装至EP 管内，置于-80 ℃冰箱保存。按照试剂盒说明书步骤操作，采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中CRP、RF、AST、ALT、CR、BUN 水平。

1.7 HE 染色法观察小鼠踝关节滑膜病理变化 小鼠踝关节固定于4%福尔马林中48 h 后，使用10%EDTA 溶液进行脱钙，直至用针刺入组织无阻力感为止。将脱钙后的组织放于脱水盒内，于脱水机内依次用梯度乙醇进行脱水、包埋和切片。切片脱蜡至水化，以Mayer 氏苏木素染细胞核，伊红染细胞质，脱水封片后在显微镜下观察。进行组织学评分，滑膜血管：HE 染色5 个高倍镜视野下滑膜血管数目，取平均值；滑膜炎症：HE 染色5 个高倍镜视野下单核炎症细胞浸润情况；以及对滑膜增生程度进行评分，具体方法及评分标准[11]见表1。

表1 关节组织学评分标准Table 1 Joint histologic scoring

1.8 番红固绿染色法观察小鼠踝关节软骨及骨质结构变化 切片步骤同“1.7”项下，石蜡切片脱腊至水化，先后予番红O 及固绿染色，脱水封片后在显微镜下观察。进行组织学评分，软骨侵袭：评估软骨丢失的比例；骨破坏：在不同倍镜视野下评估骨质破坏程度。具体方法及评分标准[11]见表1。

1.9 Micro-CT 三维重建观察小鼠踝关节骨皮质表面变化 将小鼠踝关节整体用4%多聚甲醛溶液固定后，采用高分辨率的Skyscan 1172 型Micro-CT 系统对骨骼架构进行了扫描分析。扫描参数：分辨率为5 μm，电压为80 kV，电流为88 μA。扫描完成后使用CT-vox 软件进行三维重建。

1.10 免疫组化法检测小鼠踝关节滑膜CD31、HIF-1α及VEGF-α 的表达 切片步骤同“1.7”项下，切片脱蜡至水化，枸橼酸修复；封闭后滴加一抗［CD31（1∶50）、HIF-1α（1∶200）、VEGF-α（1∶50）］，4 ℃下孵育12 h；加入二抗（1∶200）后在37 ℃下孵育30 min；然后进行DAB 显色、苏木素复染、盐酸乙醇分化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最终晾干封片。利用数字病理扫描仪进行玻片扫描，在关节部位选取3 个视野，利用ImageJ 软件进行积分光密度值（IOD/Area）计算，取均数进行统计学分析[12]。

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析；计量资料满足正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）， 若方差齐性则两两比较使用Bonferroni 分析，方差不齐使用Tamhane’s T2 法。计量资料不符合正态分布者，采用非参数分析，用中位数M（下四分位数P25，上四分位数P75）表示。重复测量数据，符合正态分布及方差齐性者采用重复测量方差分析，不符合正态分布及方差齐性者采用重复测量-广义线性模型估计方程；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 南续益母颗粒对CIA 小鼠踝关节肿胀的影响 结果见图1、图2。与正常组比较，模型组小鼠的踝关节及足面明显肿胀，活动度明显受限，AI 评分显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，甲氨蝶呤组和南续益母颗粒组小鼠的踝关节及足面红肿均有改善，小鼠关节活动度基本正常，AI 评分显著下降（P＜0.01）。结果表明，南续益母颗粒能明显改善CIA 小鼠的关节肿胀程度。

图1 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节肿胀程度的影响Figure 1 Effect of Nanxu Yimu Granules on ankle swelling in collagen-induced arthritis mice

图2 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠关节炎指数（AI）评分的影响［M（P25，P75），n=10］Figure 2 Effect of Nanxu Yimu Granules on arthritis index score of collagen-induced arthritis mice［M（P25，P75），n=10］

2.2 南续益母颗粒对CIA 小鼠血清生化指标的影响结果见图3。各组小鼠之间的血清AST、ALT、BUN、CR、RF 水平无明显变化（P＞0.05）。与正常组比较，模型组小鼠血清中的炎症指标CRP 水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，甲氨蝶呤组小鼠血清CRP 水平明显下降（P＜0.05），南续益母颗粒组小鼠血清CRP 水平有一定程度下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，南续益母颗粒对CIA小鼠有一定的抗炎作用，且对肝肾功能无明显毒性。

图3 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠血清生化指标的影响［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 3 Effect of Nanxu Yimu Granules on serum indicators in collagen-induced arthritis mice［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.3 南续益母颗粒对CIA 小鼠踝关节滑膜病理变化的影响 结果见图4、图5。与正常组比较，模型组小鼠踝关节可见显著滑膜增生（P＜0.001）和炎性浸润（P＜0.001），血管数量显著增加（P＜0.001）。与模型组比较，甲氨蝶呤组和南续益母颗粒组小鼠踝关节的滑膜增生和炎性浸润均明显减轻（P＜0.05），血管数量显著减少（P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，南续益母颗粒能减轻CIA 小鼠踝关节的滑膜病理改变。

图4 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节滑膜病理变化的影响（HE 染色）Figure 4 Effect of Nanxu Yimu Granules on pathological changes of ankle synovium in mice with collagen-induced arthritis（HE staining）

图5 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节滑膜病理变化的影响［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 5 Effect of Nanxu Yimu Granules on pathological changes of ankle synovium in mice with collagen-induced arthritis［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.4 南续益母颗粒对CIA 小鼠踝关节软骨及骨质结构变化的影响 结果见图6、图7。与正常组比较，模型组小鼠踝关节可见显著软骨侵袭和骨破坏（P＜0.001）。与模型组比较，甲氨蝶呤组和南续益母颗粒组小鼠踝关节软骨侵袭明显改善（P＜0.05），骨破坏程度明显减轻（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，南续益母颗粒能减轻CIA 小鼠踝关节的软骨及骨质病理改变。

图7 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节软骨及骨质结构变化的影响［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 7 Effects of Nanxu Yimu Granules on the changes of ankle cartilage and bone structure in mice with collagen-induced arthritis［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.5 南续益母颗粒对CIA 小鼠踝关节骨皮质表面变化的影响 结果见图8。与正常组比较，模型组小鼠踝关节骨质出现明显局灶性侵蚀，骨表面失去光滑及完整性，部分关节融合呈强直状。与模型组比较，南续益母颗粒组和甲氨蝶呤组小鼠踝关节骨质破坏程度明显减轻，骨表面轻度粗糙，小部分存在局灶性侵蚀。结果提示，南续益母颗粒可明显抑制CIA 小鼠的骨质破坏。

图8 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节骨皮质表面变化的影响Figure 8 Effect of Nanxu Yimu Granules on the changes of ankle cortical bone surface in mice with collagen-induced arthritis

2.6 南续益母颗粒对CIA 小鼠踝关节滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表达的影响 结果见图9、图10。与正常组比较，模型组小鼠踝关节滑膜中CD31 免疫组化染色突出的血管数量明显增加，CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表达显著上调（P＜0.001）。与模型组比较，甲氨蝶呤组和南续益母颗粒组小鼠踝关节滑膜血管数量减少，CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表达明显下调（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，南续益母颗粒能明显抑制滑膜血管翳的生成，可能与抑制HIF-1α/VEGF-α 信号通路相关。

图9 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表达的影响（免疫组化，×400）Figure 9 Effects of Nanxu Yimu Granules on protein expressions of CD31，HIF-1α and VEGF-α in ankle joints of mice with collageninduced arthritis（IHC，×400）

图10 南续益母颗粒对胶原诱导型关节炎小鼠踝关节滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表达的影响（±s，n=10）Figure 10 Effects of Nanxu Yimu Granules on protein expressions of CD31，HIF-1α and VEGF-α in ankle joints of mice with collagen-induced arthritis（±s，n=10）

3 讨论

类风湿关节炎（RA）是以慢性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，全球发病率约为1%[13]。其病理过程主要包括滑膜增生、炎性细胞浸润、血管生成、血管翳形成、软骨侵袭和骨组织破坏等，其中新生血管生成被认为是RA 疾病进程中的关键环节[14]。滑膜中的新生血管促进滑膜增生和血管翳的形成，是关节病变和软骨损坏的重要因素。靶向新生血管生成已成为治疗RA 的热点方向，但目前尚未有相关抑制剂及抗体能够应用于临床[15]。

RA 属中医学“痹病”“历节病”范畴，其病因病机为本虚标实，肝肾亏虚为本，风寒湿外邪为标，久致痰瘀阻滞经脉[16]。中医理论中尚未有血管翳的相关描述，根据现代研究[17-19]解读，血管翳实质上是一种病理产物，与中医理论中“气滞血瘀”“气血痹阻”“络脉瘀阻”等理论相契合，故以祛湿化瘀通脉治疗RA 具有一定疗效。研究[20-21]发现，中药复方/有效成分可作为血管生成抑制剂对RA 动物模型发挥作用。本课题组林昌松教授通过临床实践，总结该病病机为“风湿瘀阻，筋伤骨损”，临床应用祛湿通脉法治疗RA 取得较好疗效[22]。南续益母颗粒系祛湿通脉法代表方之一，以岭南道地祛风湿药材卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤为君，祛风除湿、通经止痛；以续断为臣，补肝肾、强筋骨；以益母草活血通脉消肿；佐以红景天扶正补虚、活血行血。

本研究采用DBA/1 小鼠进行二次免疫建立CIA模型，探讨南续益母颗粒对RA 动物模型的作用及可能机制。DBA/1 小鼠品系是CIA 经典小鼠模型，具有发病率高、可重复性好的优点，其成模率在80%～100%之间，通常在初次免疫后第21～28 天发病[10]。CIA 小鼠模型为经典的RA 动物模型，与RA 具有相似的滑膜炎和骨破坏等病理特征[23]。CIA 模型的主要特征是自身胶原的耐受性破坏和自身抗体的产生，但该模型不存在类风湿因子（RF）升高[24]，这与本研究结果相符。初次免疫后第24～30 天之间，CIA 小鼠AI 评分均高于4 分，成模率可达100%[25]。甲氨蝶呤是治疗RA 的一线用药，研究[7，26]证实甲氨蝶呤对RA动物模型具有明显治疗作用，故本研究将其作为阳性对照药物。经过甲氨蝶呤和南续益母颗粒治疗后，CIA 小鼠踝关节炎症得到缓解，AI 评分明显下降。结合HE 及番红固绿染色及Micro-CT 结果，甲氨蝶呤和南续益母颗粒能明显改善CIA 小鼠踝关节滑膜增生、炎性浸润、血管新生、软骨侵袭及骨质破坏等病理改变。CRP 是RA 临床常用于评估疾病活动的炎性指标，在多种慢性炎性疾病中起着重要的调节作用。CRP 水平与RA 严重程度和进展呈正相关，能作为CIA 动物模型的药效评价指标之一[27-29]。甲氨蝶呤和南续益母颗粒能不同程度降低CIA 小鼠血清CRP 水平，具有一定的抗炎作用。

研究[30]表明，炎症、免疫失衡和缺氧是RA 滑膜新生血管形成的主要原因。HIF-1α 是在RA 缺氧滑膜中高表达的关键转录因子，与RA 滑膜新生血管生成密切相关。在缺氧条件下，HIF-1α 在细胞质中稳定存在并累积，继而转位入核，通过启动下游众多基因的转录表达而参与多种生理病理过程[37]。VEGF-α是HIF-1α 调控的关键下游基因之一，具有调控血管生成的作用[31]。大量研究[32-33]证实，RA 患者的血清、滑膜组织和体液中存在高水平的VEGF-α。阻滞VEGF 信号通路，能够显著减少CIA 小鼠滑膜血管翳的生成[7，34]。因此，阻断HIF-1α/VEGF-α 信号通路的激活，或能改善RA 病理性血管新生。本研究中，采用CD31 作为评判RA 滑膜血管翳数量的指标[25]。CD31 是一种内皮细胞标志蛋白，其免疫组化染色可将部分滑膜微血管突出标志，常作为血管生成的观察指标[35]。本研究发现，南续益母颗粒能减少CIA 小鼠关节滑膜CD31 的表达，抑制滑膜血管翳的生成，同时HIF-1α、VEGF-α 蛋白在滑膜中的表达明显下降。结果提示南续益母颗粒或通过介导HIF-1α/VEGF-α 通路减少CIA 小鼠滑膜血管翳的形成。

综上所述，南续益母颗粒对CIA 模型小鼠有明显的治疗作用，能够显著改善关节肿胀症状及其病理变化，抑制关节滑膜血管翳形成，其作用机制可能与抑制HIF-1α/VEGF-α 信号通路激活相关。本研究初步探讨了南续益母颗粒抑制CIA 小鼠血管翳的作用和机制，可为进一步拓展其在临床上的应用及相关研究奠定基础。