赵新军，黎燚华，康亮，陈琦，林莉雯，褚庆民，罗川晋，彭锐，都治伊，李荣 （.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 50405；.广州中医药大学，广东 广州 50405）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）后心力衰竭（简称心衰）发生的心室质量、容积增加和形态改变称为心室重构，以心肌细胞肥大、心肌组织纤维化等病理改变为其主要的特征性表现。抑制梗死后心肌纤维化进程是预防和治疗心衰的重要靶点[1]。心肌纤维化是由心肌成纤维细胞异常激活、心肌细胞外基质中胶原纤维过度积累、胶原浓度增加或胶原成分失衡引起的[2]。细胞外基质主要由Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原组成，占心肌间质胶原总量的90%以上，维持心肌间质胶原的适当比例对心脏功能的完整性具有重要意义[3]。

近几年，慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）的治疗有了较大的突破，如钠葡萄糖共转运蛋白2 抑制剂（SGLT-2i）、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（ARNI）等新型药物的面世，降低了CHF 的发病率和死亡风险[4-5]。然而，CHF 的远期预后仍不佳，5 年生存率仍较低[6]。因此，积极寻找改善CHF的有效药物是当前心血管领域的研究热点。

CHF 归属于中医“喘证”“心水”“胸痹”等范畴，基本病机为气虚、血瘀、水停，治法主要有益气、活血、化瘀、温阳等。本课题组李荣教授结合多年的临床经验，提出“毒邪”的特殊病机，对目前心衰病因病机做了重要补充，并研发了金欣康颗粒作为心衰治疗的基础方[7]。课题组前期对金欣康颗粒的临床疗效及安全性进行了预试验。结果表明，金欣康能改善左室收缩功能，缓解呼吸困难、双下肢水肿等症状，运动耐量及生活质量有所提高，且未发现明显不良事件。药理研究[8]发现，金欣康颗粒可降低利钠肽（BNP）水平，延缓心室重构，降低心肌纤维化，从而发挥心肌保护作用。本研究从线粒体自噬蛋白LC3/Beclin1 表达方面进一步探讨金欣康颗粒对心衰病理过程中心肌纤维化的作用，以明确其改善心衰心肌纤维化的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量200 ～250 g，广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034。大鼠在无致病菌环境中饲养，在恒温（20～22 ℃），自由饮水，12 h∶12 h 光-暗循环光照条件下，按照广州中医药大学第一附属医院动物保护和使用机构委员会要求进行实验，实验动物伦理审批号：TCMF1-2019020。大鼠需适应性喂养1 周后开始实验。

1.2 药物与试剂 金欣康颗粒（由丹参、桂枝、黄芪、人参、毛冬青等7 味药组成）和安慰剂由华润三九医药股份有限公司制备，批号：J2211006、2205001H。其中安慰剂以5%实验药、苦味剂、着色剂等辅料配制，色泽、口感与实验药基本一致；培哚普利，施维雅制药有限公司，批号：H20034053；天狼猩红染色液，索莱宝生物有限公司，批号：G1470；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批号：TA-08）、辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L），（批号：ZB-2305）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（批号：ZB-2301），中杉金桥生物技术有限公司；Rabbit Anti LC3 一抗（批号：ab51520）、Rabbit Anti Beclin1 一抗（批号：ab207612）、α-SMA 一抗（批号：ab7817），英国abcam 公司；CollagenⅠ一抗，北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0578R；Collagen Ⅲ一抗，美国Affinity 公司，批号：af0136；DAB 显色试剂盒（批号：CW0125）、中性树脂（批号：CW01360），康为世纪科技公司；苏木素染色，博生德生物公司，批号：AR1180-1。

1.3 仪器 DYY-6C 型蛋白垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；Chemi DocTMXRS+型超高灵敏度化学发光成像系统，伯乐生命医学产品有限公司；CKX53 Olympus 型荧光显微镜，北京瑞科中仪有限公司；JEM-1400PLUS 透射电子显微镜，日本JEOL 公司；DW-3000C 小型动物呼吸机，北京众实迪创科技发展有限公司。

1.4 心梗大鼠模型的复制 大鼠适应性饲养1 周，随机选取50 只大鼠进行心梗模型制备，以左冠状动脉前降支结扎术构建心肌梗死模型[9]。大鼠称体质量后以1%戊巴比妥钠腹腔注射（45 mg·kg-1）麻醉，备皮，酒精和碘伏消毒，使用改良的经口气管插管法进行气管插管并连接呼吸机[10]，正压通气，潮气量12 mL·kg-1，频率100 次·min-1。在胸骨旁约1 cm纵向开口约3 cm，钝性分离肌肉，剪断第3、4 肋骨，用自制拉钩打开胸腔暴露心脏，在左心耳下缘3 ～4 mm 处用6-0 缝合线结扎左冠脉前降支。心肌梗死大鼠模型成功的标志[9]：连接心脏电生理记录仪，标准肢体Ⅱ导联出现ST 段抬高，并肉眼观察到结扎区变白或变灰白色，应尽快将心脏放回胸腔，立即分层缝合；用注射器将胸腔内的血液和空气抽尽，并给予术口消毒；术后每隔30 min 复查1 次心电图，如连续2 次ST 段抬高，表示心梗造模成功。同法制备假手术大鼠，穿线但不结扎，4-0 缝合线关闭胸腔，逐层缝合肌肉和皮肤。观察大鼠呼吸状态，约5 min 后拔掉呼吸机，将大鼠放入保温毯上，苏醒后放回鼠笼中。

1.5 分组及给药 造模2 周后，对存活心梗大鼠行多普勒超声心动图[11]，剔除了心衰造模不成功大鼠5 只，另有死亡5 只，造模成功大鼠40 只。模型大鼠随机分为4 组，分别为模型组（Model），金欣康颗粒低剂量组（JXK-L），金欣康颗粒高剂量组（JXK-H）和培哚普利组（PDPL）。另设假手术组（Sham）。每天分2 次灌胃给药（早上8 点和下午4 点）。假手术组予等量生理盐水，模型组予等量安慰剂。依据《药理学实验方法》[12]设计大鼠给药剂量，金欣康颗粒低、高剂量分别为1 700 mg·kg-1（临床等效剂量）和3 400 mg·kg-1（2 倍临床等效剂量），培哚普利剂量为0.41 mg·kg-1，灌胃体积为10 mL·kg-1。连续给药12 周。于第12 周末，异氟烷麻醉大鼠，经腹主动脉注射10% KCl 注射液处死，将左心室肌（非梗死区心肌）分为两部分。一部分心肌予4%多聚甲醛固定，并行石蜡包埋；另外一部分置于-80 ℃中保存备用。

1.6 心脏超声动态观察大鼠心脏结构变化 于术前及术后第2、14 周检测多普勒超声心动图，探头频率为12 MHz，采用标准的左室长轴切面、心尖四腔心切面，同时记录心电图，以R 波顶峰为舒张末期，以T 波末为收缩末期，仔细观察心脏的形态、室壁运动幅度及收缩期增厚率。形态学指标包括：左室舒张末期内径（LVEDd）及收缩末期内径（LVEDs），左室舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）；收缩功能指标包括：射血分数（LVEF）、短轴缩短率（LVFS）。射血分数用Simpsons 法测定。

1.7 HE 染色法观察心肌组织病理变化及存活心肌细胞数量 取经4%多聚甲醛固定、乙醇脱水、包埋的心肌组织进行切片，厚度为3 ～4 μm；经二甲苯梯度脱蜡，不同浓度乙醇梯度脱水后，采用苏木素-伊红（HE）染色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察心肌组织病理变化及单位面积内心肌细胞数量。计数方法：将切片置于光镜下，随机选取放大200 倍的5 个视野，进行心肌细胞计数。各组心肌细胞数目以每个视野下的平均个数计算。

1.8 天狼星红染色法观察心肌间质纤维化的程度 取出各组经过包埋的心肌组织，常规切片。融化石蜡，浸泡在重铬酸钾浸泡过夜，Weigert 氏铁苏木素染色5 min，清洗后用1%盐酸酒精分化10 s，冲洗后返蓝；然后，用丽春红酸性品红液染5～10 min，磷钼酸水溶液浸泡3～5 min，苯胺蓝染料溶液染色3～6 min；最后，用1%冰醋酸分化，无水乙醇脱水，中性胶密封，显微镜下观察。使用图像分析软件（Image Pro Plus 6.0，Media Cybernetics，United States）分析纤维化区域，以红色区域面积（纤维化面积）与蓝色区域面积（正常心肌面积）的比值计算胶原体积分数。

1.9 免 疫 组 化 法 检 测α- SMA、 Collagen I 和Collagen Ⅲ蛋白的表达 采用HE 染色方法，石蜡切片，常规脱蜡至水。3%H2O2室温5～10 min 灭活内源性过氧化物酶，95 ℃加热10 min 修复抗原活性；5 g·L-1羊血清室温封闭30 min，滴加稀释的一抗（1∶50），4 ℃过夜。PBS 冲洗，3 min×3 次。滴加二抗（1∶100），室温孵育10～15 min。PBS 冲洗，3 min×2 次，DAB 显色。复染，脱水，透明，封片。镜下观察α-SMA、I 型和Ⅲ型胶原（CollagenⅠ和CollagenⅢ）经免疫组化染色后细胞呈棕黄色着色为阳性。免疫组化染色结果判定：在200 倍视野下，在每张切片的非梗死区随机取5 个视野进行摄片，用Image proplus 5.0 软件分别测定α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的吸光度（A），以5 个视野的A 值的平均值作为各标本的表达值。

1.10 透射电镜观察线粒体自噬小体的形成 取4%多聚甲醛固定的非梗死区心肌组织，样本经3%戊二醛和1%四氧化锇固定，丙酮逐级脱水。依次使用丙酮渗透，将渗透好的样本块放到包埋板中，灌上环氧树脂作为包埋剂，在60 ℃的恒温箱中孵育48 h。采用超薄切片机制备约50 nm 厚的切片后，漂浮于刀槽液面上，再捞至铜网。先用醋酸铀染色，再用枸橼酸铅染色，室温下染色15 min，JEM-1400PLUS 透射电镜观察。

1.11 Western Blot 法观察线粒体自噬蛋白LC3、Beclin1 的表达 取冻存的心肌组织0.3 g 加入1 mL蛋白裂解液匀浆，离心（12 000g，4 ℃，10 min），取上清液。采用BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度；加上样缓冲液及RIPA 裂解液调整蛋白浓度，上样量30 μg；电泳：蛋白样品调至等浓度后上样，上胶电压80 V，电泳30 min，溴芬蓝跑至分离胶时，改为120 V 进行下胶电泳。当溴芬蓝跑至距胶下缘1 cm结束电泳。转膜：根据蛋白marker，将胶块切成72 ～22 kD 大小，在甲醇中浸泡15 s 转入ddH2O 中2 min，将胶和膜按2 层海绵、2 层滤纸、胶、PVDF膜、2 层滤纸和2 层海绵的“三明治”顺序，放置在转膜缓冲液中，逐出气泡，以膜面积×3 的电流转膜65 min。封闭：将膜浸没于封闭缓冲液中室温摇荡1 h。结合一抗：封闭后将膜用TBST 洗3 次，各5 min，将不同分子量的塑料膜浸于一抗缓冲液中，Rabbit Anti LC3 一 抗，Rabbit Anti Beclin1 一 抗，4 ℃静置过夜。结合二抗：将按比例稀释的二抗覆盖于PVDF 膜上，摇床室温轻摇90 min。HRP-ECL 发光鉴定：二抗孵育后，用TBST 洗膜3 次，将发光液按1∶1 的比例混匀，微量加样枪加入发光液，孵育10 s，在膜上滴加ECL 曝光液，曝光。用Quantity one 软件分析各抗体条带灰度值，作蛋白质半定量印迹统计分析[13]。

1.12 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量数据以均数± 标准差（±s）表示，各组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐时，组间比较采用LSD 法；方差不齐时，用Welch检验，组间比较采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 金欣康颗粒对心衰大鼠心脏结构和心功能的影响 结果见表1。干预12 周后，模型组大鼠死亡3 只，JXK-L 组死亡3 只，JXK-H 和PDPL 组各死亡1 只，假手术组无死亡。与假手术组比较，模型组心功能下降，LVEF 和LVFS 显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），左室心腔内径LVEDd 和LVEDs 显著增大，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明心梗造模成功。与模型组比较，JXK 低剂量组、JXK 高剂量组和培哚普利组的LVEF 和LVFS 明显提高（P＜0.01），LVEDd 和LVEDs 均显著缩小（P＜0.01）。

表1 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠心脏结构和心功能的影响（±s）Table 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiac structure and cardiac function in rats with heart failure（±s）

表1 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠心脏结构和心功能的影响（±s）Table 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiac structure and cardiac function in rats with heart failure（±s）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

LVFS/%39.00±3.53 17.12±8.38##24.03±6.23**28.72±3.49**32.68±7.58*组别假手术组模型组JXK 低剂量组JXK 高剂量组培哚普利组鼠数/只10 7799 LVEDd/mm 5.74±0.66 10.35±2.06##7.82±1.66*7.52±1.47*7.44±1.56**LVEDs/mm 3.11±0.46 7.85±2.28##5.73±1.32*5.38±1.45*4.13±1.28*LVEF/%70.15±8.04 34.30±10.11##43.20±10.36*48.66±14.12**59.48±15.66*

2.2 金欣康颗粒对心衰大鼠心肌组织病理变化及心肌细胞存活数量的影响 结果见图1。Sham 组心肌细胞形态、大小、结构正常，细胞核清晰。模型组有大片心肌细胞坏死，坏死周围及远处心肌细胞呈不同程度变性、肥大；细胞间质可见大量纤维组织沉积，心肌纤维排列紊乱；存活心肌细胞数量明显减少，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），表明本实验成功建立了心衰模型。JXK 低剂量组、JXK 高剂量组和培哚普利组均有轻度的局限性心肌细胞坏死和淋巴细胞浸润，心肌纤维化程度轻，JXK 高剂量组的心肌细胞坏死程度较JXK 低剂量轻；与模型组比较，各组单位面积内心肌细胞数显著增多，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠心肌细胞病理变化的影响（HE 染色，×200；±s，n=6）Figure 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiomyocyte pathology in rats with heart failure（HE staining，×200；±s，n=6）

2.3 金欣康颗粒对心衰大鼠心肌纤维化的影响 结果见图2。假手术组细胞间质可见少量红色胶原纤维，排列有序；模型组可见大量红色的I 型胶原沉积，心肌纤维排列紊乱及部分心肌纤维断裂；与假手术组比较，胶原纤维沉积程度显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。JXK 低剂量组、JXK 高剂量组和培哚普利组也可见部分胶原纤维，心肌细胞与胶原纤维相间呈分枝状。与模型组比较，各给药组胶原纤维沉积程度显著减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响（天狼猩红染色，×200；±s，n=6）Figure 2 Effects of Jinxinkang Granules on on myocardial fibrosis in rats with heart failure（Sirius Red Staining，×200；±s，n=6）

2.4 金欣康颗粒对心衰大鼠α-SMA、CollagenI和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响 结果见图3。与假手术组比较，模型组的心肌非梗死区组织α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，JXK 低剂量组、JXK 高剂量组和培哚普利组的α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达均有降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），心肌纤维化程度有所改善。

图3 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表达的影响（免疫组化法，×200；±s，n=6）Figure 3 Effects of Jinxinkang Granules on the protein expressions of α-SMA，CollagenⅠ，and Collagen Ⅲin rats with heart failure（Immunohistochemical，×200；±s，n=6）

2.5 金欣康颗粒对心衰大鼠心肌细胞线粒体自噬小体的影响 结果见图4。假手术组可见到丰富的线粒体，线粒体膜完整，结构正常，排列整齐。模型组心肌细胞线粒体排列紊乱，线粒体明显肿胀，并可见到较多的自噬小体，与假手术组比较，单位面积内自噬小体的数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。JXK 低剂量组、JXK 高剂量组和培哚普利组线粒体排列较为整齐，线粒体自噬小体进一步增加，单位面积内自噬小体的数量与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠线粒体自噬小体的影响（透射电镜，×10 000；±s，n=6）Figure 4 Effects of Jinxinkang Granules on mitochondrial autophagosomes in rats with heart failure（Transmission Electron microscope，×10 000；±s，n=6）

2.6 金欣康颗粒对心衰大鼠线粒体自噬相关蛋白Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3I表达的影响 结果见图5。与假手术组比较，模型组的Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达有所升高，提示心梗后自噬蛋白表达代偿性增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，JXK 高剂量组和培哚普利组Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达增加更明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图5 金欣康颗粒（JXK）对心力衰竭大鼠线粒体自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达的影响（±s，n=6）Figure 5 Effects of Jinxinkang Granules on the expressions of mitophagy-related proteins Beclin1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰin rats with heart failure（±s，n=6）

3 讨论

心肌梗死是导致慢性心衰最重要、最常见的病因，而心肌纤维化是心梗后心衰的主要病理过程之一，其特征是成纤维细胞被激活并转化为肌成纤维细胞，导致心肌中大量细胞外基质过度沉积，而持续性进展性的纤维化可导致心室壁硬度增加、顺应性降低，心功能下降，最终发展为慢性心衰[14]，因此，有效抑制及逆转心肌纤维化已成为治疗慢性心衰的重要研究方向之一。心衰的基本病机为气虚、血瘀、水停。李荣教授在前期临证实践的基础上，总结既往的辨证论治经验，提出了心衰防治的“中医金三角”理论，即：“病机金三角”“治法金三角”和“药物金三角”，以及心衰“毒证”的“四维三角”理论[7]。金欣康颗粒是在上述理论基础上拟定的中药复方制剂，具有益气温阳、活血解毒功效。该方由丹参、桂枝、黄芪、人参、毛冬青等7 味中药组成。

本研究成功复制了心梗后心衰心肌纤维化大鼠模型，给予不同剂量的金欣康颗粒干预后，心肌纤维组织中α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达明显降低；心肌组织病理损伤明显减轻，心肌细胞存活数量增加；纤维组织增生的程度相应减轻；可提高心梗后心衰大鼠的LVEF 和LVFS，缩小左室内径，改善心功能。

本研究以心梗大鼠心肌的非梗死区作为检测对象。早期研究[15]发现，非梗死区心肌功能障碍是导致整体心功能丧失的重要原因，而这部分区域的功能障碍可能继发于梗死区的形态及功能重构。Yan 等[16]研究表明非梗死区是心肌梗死后死亡率的一个强有力的预测因子，是关系心衰预后的重要指标之一。非梗死区的重构主要表现在两方面：一方面为心肌细胞的过度肥大、增长、变厚，另一方面为胶原纤维的过度增生，表现为基质中CollagenⅠ和CollagenⅢ增加，并且由弹性较好的Collagen Ⅲ转化为弹性较差的CollagenⅠ，从而使心肌的顺应性降低，僵硬度增加，最终导致心肌的舒张和收缩功能障碍[18]。本实验结果表明，模型组心肌非梗死区组织中α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达明显升高，经金欣康颗粒治疗后，α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白的表达明显降低。

心肌纤维化与自噬相关。Mellor 等[19]发现，经血管紧张素Ⅱ处理的大鼠腹腔注射自噬激动剂雷帕霉素后，心肌纤维化程度和心功能不全可得到改善。在心肌梗死大鼠模型中，以TGF-β 激活自噬，可减轻心房肌成纤维细胞的纤维化[20]。因此，自噬激活在心肌梗死后心肌纤维化过程中具有保护作用。LC3 是自噬的标志分子，也是自噬现象较为可靠的生物学标志物[21]。Beclin1 是参与细胞自噬的重要调控基因，其表达强度与自噬活性高度相关[22]。本研究发现，心衰模型建立后线粒体自噬小体表达升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 表达也升高，而给予金欣康干预后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 的表达有进一步升高趋势，这与既往的线粒体自噬研究结果基本一致[23]。在慢性心衰的不同阶段，线粒体自噬水平的表达也不同。Milonas 等[24]研究显示，心力衰竭患者的心肌细胞中Beclin-1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达增加，而随着心脏负荷减轻，Beclin-1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达亦随之降低。因此，在心衰早期线粒体自噬表达会轻度增强，但这种程度的增强并不足以调节应激状态下损伤线粒体的清除。而金欣康颗粒的干预可适度增强其表达，使其达到控制线粒体质量的平衡状态。但心衰后期，线粒体自噬水平过度增强可导致线粒体大量凋亡，影响细胞能量供给，从而加重心力衰竭[25]。因此在心衰发展的动态过程中，线粒体自噬水平的表达也处于动态变化中，所以中医药对心衰不同阶段线粒体自噬水平的调节作用有待进一步探讨。

综上所述，金欣康颗粒在心衰的易损期内能有效抑制心梗后心衰进程中心肌纤维蛋白α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达水平，减轻心肌纤维化程度。其作用机制可能与提高心衰过程中心肌线粒体自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 的表达水平有关。