姚晰晨，高爱社，田浩，张振强，宋军营，陈芳（.河南中医药大学医学院，河南 郑州 45008；.河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 45008）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经系统不可逆的退行性病变，其临床表现为进行性的认知水平下降、记忆减退和行为障碍等[1]。我国60 岁以上人群AD 的患病率约为3.9%，约占我国痴呆总患病率的65%，但随着社会老龄化继续发展，这一数据还将逐渐递增，对社会及患者家属造成沉重的压力[2]。从组织病理学上看，AD 以β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）蓄积形成的老年斑、Tau蛋白磷酸化、神经元纤维缠绕（neurofibrillary tangles，NFTs）、神经血管功能异常、神经炎症及细胞凋亡为其主要特征[3]。这些病理改变与血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的破坏密切相关[4]，BBB是由脑微血管内皮细胞通过跨膜紧密连接蛋白相互连接构成的一层特殊的致密结构，其结构的完整性可以降低循环血液中有害物质对脑组织的伤害，BBB功能障碍被认为是AD 发生发展的先兆，对于AD 的发展进程具有重要意义[5]。在AD 患者的大脑内，紧密连接蛋白表达下降或超微结构破坏会导致BBB 的完整性和功能活性受损[6]。BBB 功能异常会触发神经炎症和氧化应激，增强β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，并最终促进Aβ 的生成[7]。而异常Aβ 沉积后可通过破坏内皮细胞之间的紧密连接蛋白、促进炎症反应等途径加重BBB 功能障碍，导致神经元损伤。因此，通过保护脑微血管内皮细胞的紧密连接蛋白，维持BBB 的正常功能可能是改善AD 认知功能障碍的有效途径。

AD 属于中医学“痴呆”的范畴，多因气血不足，肾精亏虚，痰瘀阻痹，渐使髓海不足、神机失用。丹萎片临床用于治疗胸痹，它来源于著名的中医经典《金匮要略》名方瓜蒌薤白白酒汤。根据“痰瘀互结”理论，国医大师雷忠义研制了此方，该方具有宽胸散结、通阳化痰、化瘀活血等功效[8]。本课题组[9]前期体外实验表明，丹蒌片醇提物具有保护BBB 紧密连接蛋白的作用，丹蒌片含药血清能减轻Aβ1-40 诱导的脑微血管内皮细胞损伤。本研究以SAMP8 小鼠作为AD 模型小鼠，探讨丹蒌片是否可以通过增强脑微血管内皮细胞中紧密连接蛋白的表达发挥保护BBB 的功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物5 月龄SPF 级雄性SAMP8 快速衰老小鼠36 只，体质量（35±3）g，同月龄SPF 级雄性SAMR1 正常老化小鼠12 只，北京华阜康实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2020-0004；动物质量合格证号：37009200004690。所有实验均通过河南中医药大学动物伦理委员会批准，编号：DWLL201904105。

1.2 药物与试剂丹蒌片，吉林康乃尔药业股份有限公司，批号：20190107；多奈哌齐，卫材药业有限公司，批号：1701069。参照陈奇主编的《中药药理实验方法学》（第3 版）计算给药剂量，丹蒌片的给药剂量按60 kg 成人1 日用药量进行换算，成人丹蒌片用量为0.075 g·kg-1·d-1，经体表面积折算后，小鼠等效剂量为1.350 g·kg-1·d-1，多奈哌齐给药剂量为0.747 mg·kg-1·d-1。Occludin 抗体，英国Abcam 公司，批号：ab216327；ZO-1 抗体，美国Boster 公司，批号：A00513-1；Claudin-5 抗体，美国Invitrogen公司，批号：PA5-30193；Gapdh 抗体，美国Boster公司，批号：A00227；MMP-9 抗体，美国Boster公司，批号：3852S。

1.3 仪器Morris 水迷宫，深圳瑞沃德生命科技有限公司；Y 迷宫，深圳瑞沃德生命科技有限公司；JEM1400 透射电子显微镜，日本电子株式会社；AL204 型万分之一精密电子秤，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；KZ-III-F 型高速低温组织研磨仪，武汉塞维尔生物科技有限公司；Mini-ProteanTetra 型电泳转膜仪、Mini-PROTEAN 型自动凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司。

1.4 动物模型、分组和给药SAMP8 小鼠可表现出AD 发病机制中大部分特征，如BBB 的破坏、认知记忆功能下降等，因此SAMP8 小鼠常作为经典AD 模型小鼠[10]。SAMR1 小鼠的生理过程与其他品系的正常小鼠相似，一般作为SAMP8 小鼠的正常对照[11]。选取5 月龄SPF 级雄性SAMP8 小鼠36 只，随机分为3 组：模型组、丹蒌片组和多奈哌齐组（阳性对照组），每组12 只。另以12 只同月龄SAMR1 小鼠设为正常对照组。各给药组按上述剂量给药，正常组和模型组给予同等体积生理盐水灌胃，灌胃体积为10 mL·kg-1，每日1 次，共灌胃8 周。

1.5 Morris 水迷宫实验小鼠灌胃2 月结束前1 周进行水迷宫实验[12-13]。于测试前1 d 进行初筛，剔除不合格小鼠。进行为期5 d 定位航行实验，记录小鼠在60 s 内寻找平台时间（逃避潜伏期）。在实验第6 天撤除平台，自由游泳60 s 测试空间探索能力。记录小鼠在各象限停留的时间及穿越平台次数。

1.6 Y 迷宫实验水迷宫实验结束后第二天进行Y 迷宫实验。在Y 迷宫三个臂的交汇处将小鼠朝着同一个方向放入，自由活动5 min，记录小鼠总进臂次数及进臂顺序。根据小鼠总进臂次数及准确交替次数，得出自发交替准确率，计算公式为：自发交替准确率=（总的正确进臂顺序/总进臂次数－2）×100%[14]。其中，小鼠连续进入3 个不同的臂视为准确交替1 次，代入公式计算出各组小鼠自发交替准确率。

1.7 透射电子显微镜观察各组小鼠海马区脑微血管超微结构每组随机取3 只小鼠麻醉，断头取出小鼠海马脑组织，于2.5%戊二醛固定液中4 ℃过夜；1%锇酸固定1.5 h，丙酮梯度脱水，EPON812 树脂包埋，干燥箱中梯度聚合；超薄切片（70 nm），捞于100 目铜网上，醋酸双氧铀-柠檬酸铅法染色，透射电镜观察。

1.8 Western Blot 法检测各组小鼠Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 的表达水平每组取6 只小鼠颈椎脱臼处死，迅速取出小鼠海马组织，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。取出海马组织放入研磨管内，加入适量RIPA 裂解液，研磨机粉碎后放入低温离心机离心，离心半径8.6 cm，4 ℃，15 000 r·min-1，10 min。离心后取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，之后各组取20 μg 进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳后将蛋白转移至0.45 μm PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭PVDF 膜1 h，用PBST 稀释一抗工作液：Claudin-5（1∶1 000）；Occludin（1∶1 000）；ZO-1（1∶1 000）；MMP-9（1∶1 000）。一抗孵育4 ℃过夜，用PBST 稀释二抗（1∶1 000）；二抗为HRP 标记山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG，内参为Gapdh（1∶5 000），使用ECL发光液显影，以Las-4000 化学发光检测仪进行成像并分析数据。

1.9 统计学处理方法采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以（±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法（LSD-t）检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹蒌片对SAMP8 小鼠学习记忆能力的影响

2.1.1Morris 水迷宫实验 与正常组相比，模型组的平均逃避潜伏期在第4 天起开始延长（P＜0.01）。与模型组相比，丹蒌片组及多奈哌齐组逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。在第6 天的空间探索实验中，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的穿越平台次数减少、目标象限停留时间减少（P＜0.01），与模型组小鼠相比，丹蒌片组和多奈哌齐组小鼠的穿越平台次数均增加（P＜0.01，P＜0.05），目标象限停留时间均增加（P＜0.05）。见表1 、表2 和图1。

图1 各组小鼠Morris 水迷宫检测60 s 轨迹图Figure 1 Trace for 60 s econds by Morris water maze detection in each group of mice

表1 丹蒌片对SAMP8 小鼠定位航行能力的影响（±s，n=6）Table 1 Effect of Danlou Tablets on the ability of positioning navigation of SAMP8 mice（±s，n=6）

表1 丹蒌片对SAMP8 小鼠定位航行能力的影响（±s，n=6）Table 1 Effect of Danlou Tablets on the ability of positioning navigation of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别正常组模型组丹蒌片组多奈哌齐组剂量/（g·kg-1·d-1）逃避潜伏期/s 5 d 37.55±1.24 48.00±3.28##38.11±3.24**38.52±1.64**--1.350 0.747×10-3 1 d 54.23±5.87 57.28±4.51 53.07±9.11 53.38±4.93 2 d 53.52±3.39 54.96±5.27 49.61±5.75 50.79±5.83 3 d 47.33±1.70 53.08±3.61 47.37±1.34 45.94±3.37 4 d 41.59±6.18 51.63±4.37##43.92±6.14*43.02±3.15*

表2 丹蒌片对SAMP8 小鼠空间探索能力的影响（±s，n=6）Table 2 Effect of Danlou Tablets on the ability of spatial exploration of SAMP8 mice（±s，n=6）

表2 丹蒌片对SAMP8 小鼠空间探索能力的影响（±s，n=6）Table 2 Effect of Danlou Tablets on the ability of spatial exploration of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

目标象限停留时间/s 24.79±5.27 16.55±3.47##22.14±2.05*22.57±2.35*组别正常组模型组丹蒌片组多奈哌齐组剂量/（g·kg-1·d-1）--1.350 0.747×10-3跨越平台/次2.56±0.68 1.22±0.63##2.33±0.67**2.22±0.63*

2.1.2Y 迷宫实验 与正常组相比，模型组小鼠的进臂总次数和自发交替准确率显著降低（P＜0.01，P＜0.001），与模型组小鼠相比，丹蒌片组和多奈哌齐组小鼠的进臂总次数和自发交替准确率均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 丹蒌片对SAMP8 小鼠辨别学习参考能力的影响（±s，n=6）Table 3 Effect of Danlou Tablets on the discriminative learning ability of SAMP8 mice（±s，n=6）

注：与正常组比较，##P＜0.01，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

剂量/（g·kg-1·d-1）自发交替准确率/%48.00±9.35 27.63±6.28###44.14±8.53**44.57±6.46**组别正常组模型组丹蒌片组多奈哌齐组--1.350 0.747×10-3进臂总次数/次38.00±4.36 27.50±4.65##34.33±2.29*35.33±3.59*

2.2 丹蒌片对SAMP8 小鼠海马区脑微血管内皮细胞紧密连接超微结构的影响正常组小鼠海马脑组织可见光滑完整的椭圆形毛细血管腔，内皮细胞和周细胞紧密附着于血管腔周围，脑微血管内皮细胞的紧密连接清晰可见。与正常组相比，模型组可见紧密连接间隙增宽，内皮细胞内超微结构受损。与模型组相比，丹蒌片组和多奈哌齐组的脑微血管内皮细胞间隙紧密连接的膜结构较清晰，少部分见到间隙略增宽。见图2。

图2 丹蒌片对SAMP8 小鼠海马脑微血管内皮细胞紧密连接超微结构的影响Figure 2 Effect of Danlou Tablets on ultrastructural changes of tight junction of brain microvascular endothelial cells in hippocampal tissue of SAMP8 mice

2.3 丹蒌片对SAMP8 小鼠紧密连接蛋白及MMP-9表达的影响与正常组相比，模型组小鼠的紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表达下降（P＜0.05），MMP-9 的表达上调（P＜0.01）；与模型组相比，丹蒌片组小鼠的Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表达上调（P＜0.05），而MMP-9 的表达下调（P＜0.05）；多奈哌齐组小鼠的Claudin-5、ZO-1 的表达上调（P＜0.05，P＜0.01），MMP-9 的表达下调（P＜0.01）。见图3、表4。

图3 各组小鼠海马组织Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表达Figure 3 The protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in the hippocampal tissue of mice in each group

表4 丹蒌片对各组小鼠海马组织Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表达的影响（±s，n=6）Table 4 Effects of Danlou Tablets on the protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in hippocampal tissue of mice in each gruop（±s，n=6）

表4 丹蒌片对各组小鼠海马组织Claudin-5、Occludin、ZO-1 和MMP-9 蛋白表达的影响（±s，n=6）Table 4 Effects of Danlou Tablets on the protein expressions of Claudin-5，Occludin，ZO-1 and MMP-9 in hippocampal tissue of mice in each gruop（±s，n=6）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

MMP-9 1.06±0.03 1.33±0.05##1.09±0.05*1.06±0.09**组别正常组模型组丹蒌片组多奈哌齐组剂量/（g·kg-1·d-1）--1.350 0.747×10-3 Claudin-5 1.35±0.07 0.82±0.06#1.27±0.06*1.23±0.16*Occludin 1.73±0.05 1.38±0.09#1.68±0.05*1.45±0.08 ZO-1 1.91±0.17 1.40±0.06#1.61±0.05*1.45±0.11**

3 讨论

近年来研究发现，BBB 的损伤在AD 的发生发展中具有关键作用。Zlokovic 等[15]首次提出AD 神经血管假说，Aβ 在BBB 中存在清除缺陷，脑血管系统衰老和新生血管形成的改变可能导致神经血管解偶联、血管退化、脑慢性低灌注和神经血管炎症，这些事件将导致BBB 的破坏，大脑内环境平衡的失调以及突触和神经元功能衰退，最终将导致认知功能的障碍[16]。因此，降低脑微血管通透性，加速清除Aβ，改善脑部的微环境，保护BBB 功能可能是改善AD 认知功能的关键。BBB 不是一个独特的组成部分，而是由紧密连接、脑微血管内皮细胞和周细胞、星形胶质细胞末端足突形成的复杂结构[17]。脑微血管内皮细胞通过紧密连接蛋白相互联系构成BBB的基本骨架[18]。紧密连接蛋白是一种位于顶端膜附近的多分子复合物，由跨膜蛋白（Claudins、Occludins）和连接黏附分子（JAM）组成，它们是紧密连接蛋白通透性的主要决定因素，通过支架蛋白（ZO-1）等连接到肌动蛋白细胞骨架，将其定位在细胞膜上，对于保持BBB 的完整性至关重要[19]。Claudin-5 是Claudins 家族的重要成员之一，在一项敲除小鼠基因的研究中，下调Claudin-5 可引起BBB 的特异性渗漏，突出了其在BBB 功能中的重要性[20]。Occludin是一种跨膜蛋白，通过同型相互作用以增加跨内皮电阻（Transendothelial electrical resistance，TEER），对控制脑组织的钙离子浓度的稳定起重要作用，可以降低细胞损伤[21]。ZO-1 是具有多个结构域的胞质辅助蛋白，参与紧密连接蛋白的形成，ZO-1 和其他家族成员将包括Claudins，Occludin 和JAM 在内的跨膜蛋白与其他细胞质蛋白和肌动蛋白微丝相连，对BBB 的完整性具有重要作用[22]。AD 发生时常伴随着Claudins 及ZO-1、Occludin 等多种紧密连接蛋白的丧失及分布异常，神经元严重损伤，星形胶质细胞过度诱导，以及BBB 通透性增加[23]。在AD 患者大脑中，Aβ 被证明可诱导紧密连接蛋白（Claudin-5，ZO-1，Occludins）的变化，导致AD 患者的屏障功能障碍和血管通透性增加[24]。在基质金属蛋白酶（MMPs）家族中，基质金属肽酶9（MMP-9）是与AD 及BBB 相关的重要蛋白质。既往研究[25]表明，MMP-9 可以降解血管内皮基底层和紧密连接蛋白，从而破坏BBB 的完整性。中药白藜芦醇对AD 大鼠BBB 完整性的保护作用是通过降低MMP-9 的表达以及增加Claudin-5的表达来实现的[26]。另一项研究[27]发现，检测AD 患者的脑脊液血浆发现MMP-9 水平明显升高，表明MMP-9 可能会增加BBB 的通透性、激活炎症因子，并加速AD 的发展进程。而缺氧复氧模型诱导的脑微血管内皮细胞对BBB 的破坏作用与MMP-9 的表达增加有关，MMP-9 主要通过紧密连接蛋白如ZO-1，Occludin 和Claudin-5 的降解来增加表达，进而干扰BBB 的完整性[28]，表明可以通过抑制MMP-9 的表达来减少紧密连接蛋白的损失，从而实现保护BBB 的目的。

丹蒌片主治痰瘀互结之证，可通过调控不同生物学过程发挥活血化瘀、抗炎降脂、抗动脉粥样硬化等作用[29]。该方中君药为薤白和瓜蒌，可宽胸散结，化瘀通阳；赤芍和丹参可通络活血；葛根和黄芪升举阳气，补气健脾行血；泽泻可利水渗湿；具有引经功效的郁金、川芎和丹参专入心肝二经，活血化瘀，理气养血。全方宽胸通阳，化痰散结，活血化瘀，乃瘀血阻痹，脑脉不通之良方，可用于治疗AD[30-31]。药理学研究[32]表明，丹蒌片有促进微循环、降低血脂水平及治疗动脉粥样硬化等作用。

衰老加速小鼠（SAM）是最初从AKR/J 小鼠开发的近交系小鼠，SAMP8 小鼠是AD 的理想动物模型[33]。本实验选取5 月龄SAMP8 和SAMR1 小鼠，灌胃2 个月给药后，进行行为学实验检测小鼠的学习记忆和工作记忆能力。Morris 水迷宫实验和Y 迷宫实验结果表明，与正常组小鼠相比，快速老化SAMP8 小鼠在Morris 水迷宫和Y 迷宫中均表现出明显的学习记忆衰退和工作记忆下降，而经过丹蒌片进行干预后，学习记忆能力和工作记忆能力有所提高，认知功能障碍有所改善。电镜结果显示，与正常组相比，模型组紧密连接间隙增宽，内皮细胞内超微结构受损。丹蒌片干预后，脑微血管内皮细胞紧密连接间隙整体变小，膜结构较清晰，部分恢复正常。Western Blot 法检测结果显示，与对照组比较，SAMP8 小鼠在7 月龄时出现紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表达减少，而丹蒌片干预后能够抑制MMP-9 的表达，减少SAMP8 小鼠的紧密连接蛋白丢失，结合行为学结果，提示丹蒌片能改善SAMP8 小鼠的认知障碍及记忆能力，其作用机制可能与抑制MMP-9 的表达，减少紧密连接蛋白丢失，维护BBB 功能有关。