李玉平，李海洋，姜珊珊，唐文超，陈瑞，杨长福，柯尊丽（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除酒精、肝炎病毒、药物以及其他明确的肝损伤因素外，以肝实质细胞脂质堆积和脂肪变性为特征的临床病理综合征[1]。随着社会发展及人们生活方式的改变，我国NAFLD 平均患病率高达29.2%[2]，成为除慢性乙型肝炎外影响人们肝脏健康的最主要原因。NAFLD 被认为是代谢综合征在肝脏的病理表现，但其肝外的并发症状同样严重，是心脑血管疾病和慢性肾病的独立危险因素[3-4]。然而目前临床上缺乏有效的NAFLD 治疗药物。

二陈汤源于宋代《太平惠民和剂局方》，由半夏、陈皮、茯苓和甘草组成，本研究所用的加味二陈汤即在此基础上加白术构成。现代药理学研究显示，半夏具有降血脂、抗炎的作用[5-6]；陈皮具有降低血脂及肝脂的作用[7]；茯苓可促进肝再生速度和防止肝细胞坏死[8]；甘草中的总黄酮等成分具有降糖、降脂、抗氧化及保肝等作用[9-10]；白术具有促进肝脏脂肪转运、降血脂等作用[11-12]。多项临床观察[13-19]表明，二陈汤加减治疗NAFLD 临床疗效显著，患者的转氨酶、血脂水平显著降低，胰岛素抵抗得到改善，但其具体作用机制尚未明确。故本研究拟基于SIRT1/AMPK/SREBP-1c 通路探讨加味二陈汤对高脂膳食诱导的NAFLD 小鼠脂质代谢的影响及作用机制，以期为其临床治疗NAFLD 提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料SPF 级健康C57BL/6 雄性小鼠40 只，6～8 周龄，体质量18～22 g，购自长沙天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019- 0014，动物质量合格证号：430726210100105236。高脂饲料（D12492）、正常饲料（D12450B），均购自美国Research Diets 公司。动物饲养于贵州中医药大学实验动物研究所动物房，室温：（25±1）℃，相对湿度：50%～70%。本实验获得贵州中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理编号：20210014。

1.2 药物及试剂半夏、陈皮、茯苓、甘草、白术药材，均购自贵州中医药大学第一附属医院，经贵州中医药大学杨长福教授鉴定为正品。阿托伐他汀钙片（批号：202007110B），浙江乐普制药有限公司；总RNA 提取试剂（批号：20210918）、蛋白提取试剂盒（批号：20190719）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：20210219）、SDS-PAGE 凝胶试剂盒（批号：20190314），均购自北京索莱宝科技公司；反转录试剂盒（批号：S01GA241）、cDNA 扩增试剂盒（批号：S01FD261），均购自北京康润诚业生物科技公司；沉默信息调节因子1（SIRT1）鼠抗（批号：60303-1-Ig）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）鼠抗（批号：66536-1-Ig），均购自Proteintech 中国公司；甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）兔抗（批号：33w8520），美国Affinity 公司；β-actin 兔抗（批号：AA1217J1199ZJ1）、抗兔二抗（批号：AA122028）、抗鼠二抗（批号：AA88191），均购自南京巴傲德公司；总胆固醇（TC，批号：20220420）、甘油三酯（TG，批号：20220420）、谷草转氨酶（AST/GOT，批号：20210818）、谷丙转氨酶（ALT/GPT，批号：20210817）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，批号：20210819）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，批号：20210819）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：20210803）、总谷胱甘肽（TGSH，批号：20210808）检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；HE染液套装（批号：G1003），武汉赛维尔生物科技公司。

1.3 主要设备ISKANMK3 型酶标仪、CRYOSTAR NX50 型冰冻切片机，美国Thermo 科技公司；CFX 96 Touch qPCR 仪、Universal HoodⅡ型凝胶成像分析系统、10006938RevB 型蛋白凝胶电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Accu-Chek Active[Model GB]血糖仪，瑞士罗氏血糖健康医护公司；RM2016 型病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；Eclipse E100 型正置光学显微镜，日本尼康公司。

1.4 药物制备将半夏、陈皮、茯苓、甘草、白术中药饮片按3∶2∶3∶1∶3 的比例混合后打粉，分别加入10、8、8 倍质量的水煎煮3 次，每次2 h，经4 层纱布过滤后浓缩成1.2、2.4 g·mL-1生药浓度；用生理盐水将阿托伐他汀钙片溶解成5 mg·mL-1溶液；将上述药液分装后-20 ℃保存，临用当天将药液于4 ℃冰箱解冻，37 ℃预热后使用。

1.5 分组、模型复制及给药将40 只小鼠适应性饲养1 周后，随机分为5 组：正常组、模型组、阿托伐他汀组（0.05 g·kg-1）及加味二陈汤低、高剂量组（12、24 g·kg-1），称量并记录各组小鼠体质量。正常组给予正常饲料自由取食，其余各组自由取食高脂饲料，连续饲养10 周复制NAFLD 小鼠模型。造模结束后，按10 mL·kg-1给药体积给予阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠灌胃给药，给予正常组、模型组生理盐水灌胃，每日1 次，连续给药6 周。

1.6 血糖测量及标本采集第16 周结束给药前，小鼠禁食12 h 后测定空腹血糖值（t= 0 min）；然后腹腔注射1 g·kg-1葡萄糖溶液，分别于注射后15、30、60、90、120 min 测定小鼠血糖值。给药结束后，小鼠禁食不禁水过夜，用20%乌拉坦麻醉小鼠（0.01 mL·g-1），然后经心脏取血，并收集小鼠肝脏组织；部分肝脏固定于4%多聚甲醛溶液，部分肝脏直接液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存，备用；血液在室温下静置4 h 后，以3 000×g离心取血清，分装后于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.7 小鼠体质量、肝脏系数及血液、肝脏生化指标测定模型复制以及给药期间，每周测定并记录各组小鼠体质量；采集标本时，称取并记录小鼠肝脏质量，计算：小鼠肝脏系数（%）=肝质量（g）/体质量（g）×100%；检测血清浓度是否超过线性范围，如超过则用生理盐水适当稀释后再测定；准确称取肝组织质量（50 mg），按质量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例加入生理盐水，4 ℃下匀浆90 s（60 Hz），以2 500 r·min-1离心（8 cm 离心半径）10 min，取上清液待测。严格按照各试剂盒说明书步骤操作，分别检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、SOD、TGSH 及肝脏组织TC、TG 的含量或活性。

1.8 肝组织病理学观察（1）取4%多聚甲醛溶液固定后的肝组织，采用常规方法石蜡包埋、切片（5 μm）、脱蜡、苏木素-伊红染色、中性树胶封片。（2）取-80 ℃冰箱保存的肝组织，采用常规方法冰冻切片（8 μm）、复温干燥、固定液固定、油红O 染色、60%异丙醇分化、苏木素染色、甘油明胶封片剂封片。将HE 及油红O 染色后的肝组织切片在显微镜下观察，拍照。

1.9 RT-qPCR 法检测肝组织SIRT1、AMPK 及SREBP-1c mRNA 表达采用总RNA 提取试剂（TriQuick Reagent）提取肝脏组织总RNA，检测RNA含量和纯度（A260/A280=1.8～2.0）；采用StarScriptII cDNA 第一链合成预混试剂盒（含去基因组）逆转录成cDNA；进行PCR 扩增反应，反应体系：20 μL，反应条件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 个循环；取平均阈值循环数作为每个样本的Ct 值，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，实验重复3 次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.10 Western Blot 法检测肝组织中SIRT1、AMPK及SREBP-1c 蛋白表达取于-80 ℃保存的小鼠肝组织20 mg，加入RIPA 裂解液200 μL 进行匀浆；以4 ℃、14 000×g离心5 min，采用BCA 蛋白定量法测定上清液的蛋白浓度；然后取适量样品用PBS溶液稀释成200 μL，加入5×蛋白上样缓冲液50 μL，混匀后沸水煮5 min，-20 ℃保存备用。取等量蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转至PVDF 膜；室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h；分别加入一抗SIRT1（1∶3 000）、AMPK（1∶3 000）、SREBP（1∶2 000）、β-actin（1∶6 000）单克隆抗体，摇床上缓慢摇1 h 后于4 ℃下过夜；次日于摇床上缓慢摇1 h 后，TBST洗涤5 次，再分别加入二抗（1∶6 000），室温下于摇床上缓慢摇2 h；TBST 洗涤3 次，采用ECL 化学发光法进行曝光显影；扫描蛋白条带，采用ImageJ 软件分析光密度（OD）值，并以β-actin 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.11 统计学处理方法采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 加味二陈汤对NAFLD 小鼠体质量及肝脏系数的影响结果见图1。造模结束后，与正常组比较，造模组小鼠体质量显著升高（P＜0.01，P＜0.001）。给药结束后，与正常组比较，模型组小鼠的体质量、肝质量及肝脏系数显著升高（P＜0.05，P＜0.001）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠的体质量、肝质量、肝脏系数显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，加味二陈汤可改善NAFLD 小鼠的体质量及肝脏系数。

图1 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠体质量、肝质量及肝脏系数的影响（±s，n=8）Figure 1 Effects of modified Erchen Decoction on body mass，liver mass and liver coefficient of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.2 加味二陈汤对NAFLD 小鼠血脂的影响结果见图2。与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG 及LDL-C 水平显著升高（P＜0.001），HDL-C 水平显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠血清TC、TG 及LDL-C水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），HDL-C 水平显著升高（P＜0.001）。结果表明，加味二陈汤可改善NAFLD 小鼠的血脂水平。

图2 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠血脂的影响 （±s，n=8）Figure 2 Effects of modified Erchen Decoction on blood lipid of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.3 加味二陈汤对NAFLD 小鼠肝脂及肝功能的影响结果见图3。与正常组比较，模型组小鼠肝组织TC、TG 及血清ALT、AST 水平显著升高（P＜0.05，P＜0.001）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠肝组织TC、TG 及血清ALT、AST 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，加味二陈汤可改善NAFLD 小鼠的肝脂水平及肝功能。

图3 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脂及肝功能的影响（±s，n=8）Figure 3 Effects of modified Erchen Decoction on liver lipid and liver function of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.4 加味二陈汤对NAFLD 小鼠抗氧化水平及血糖耐受的影响结果见图4。与正常组比较，模型组小鼠的血清SOD、TGSH 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.001），空腹及注射葡萄糖后（15、30、60、90、120 min）的血糖水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠的血清SOD、TGSH 水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），空腹及注射葡萄糖后（15、30、60、90、120 min）的血糖水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，加味二陈汤可改善NAFLD 小鼠抗氧化水平及血糖耐受。

图4 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠抗氧化能力及血糖水平的影响（±s，n=8）Figure 4 Effects of modified Erchen Decoction on antioxidant and blood glucose levels of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=8）

2.5 加味二陈汤对NAFLD 小鼠肝脏组织病理变化的影响结果见图5。HE 染色发现，正常组小鼠肝组织细胞核呈蓝色，细胞质呈均匀红色，未见有空泡；模型组小鼠肝组织细胞质可见大量的空泡，说明16 周的高脂饲养导致了小鼠肝脏脂质的大量堆积；阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠较模型组肝组织病理变化均有明显的改善。油红O 染色发现，正常组小鼠肝细胞核呈蓝色，肝细胞内未见橘红色脂滴，肝细胞间隙清晰；模型组小鼠肝细胞胞质出现大量红染的脂滴，较多细胞内脂滴融合变大；阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠较模型组肝组织细胞胞质内橘红色脂滴显著减少。结果表明，加味二陈汤对NAFLD 小鼠肝细胞脂质蓄积有显著改善作用。

图5 各组小鼠的肝脏组织病理染色（HE、油红O 染色，×200）Figure 5 Pathological staining of liver tissue of mice in each group（HE and oil red O staining，×200）

2.6 加味二陈汤对NAFLD 小鼠肝脏组织SIRT1、AMPK、SREBP-1c mRNA 表达的影响结果见图6。与正常组比较，模型组小鼠肝组织SIRT1、AMPK mRNA 表达显著下调（P＜0.01），SREBP-1c mRNA 表达显著上调（P＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠肝组织SIRT1、AMPK mRNA 表达显著上调（P＜0.01，P＜0.001），SREBP-1c mRNA 表达显著下调（P＜0.01，P＜0.001）。

图6 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏组织SIRT1、AMPK、SREBP-1c mRNA 表达的影响（±s，n=3）Figure 6 Effects of modified Erchen Decoction on mRNA expressions of SIRT1，AMPK and SREBP-1c in liver tissue of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=3）

2.7 加味二陈汤对NAFLD 小鼠肝脏组织SIRT1、AMPK、SREBP-1c 蛋白表达的影响结果见图7。与正常组比较，模型组小鼠肝脏SIRT1、AMPK 蛋白表达显著下调（P＜0.01），SREBP-1c 蛋白表达显著上调（P＜0.001）；与模型组比较，阿托伐他汀组及加味二陈汤低、高剂量组小鼠肝组织SIRT1、AMPK 蛋白表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），SREBP-1c 蛋白表达显著下调（P＜0.001）。

图7 加味二陈汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏组织SIRT1、AMPK、SREBP-1c 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 7 Effects of modified Erchen Decoction on protein expressions of SIRT1，AMPK and SREBP-1C in liver tissue of nonalcoholic fatty liver disease mice（±s，n=3）

3 讨论

中医根据临床症状，可将非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）归属于“积症”“邪痛”“痰症”“肥气病”等范畴，病位主要在肝。饮食不节、情志失调、过度肥胖等多种因素均可诱发NAFLD[20-21]。恣食膏粱厚味，损伤脾胃，以致脾失健运，不能正常输布水液；水液代谢困难，湿浊结聚成痰，进而导致痰湿郁阻肝络，肝失疏泄，气机失调；既不能促脾之健运，亦不能促进水液运行，则进一步加重痰湿。因此，治法宜祛痰化湿，辅以疏肝健脾。二陈汤具有燥湿化痰、理气和中的功效，主治湿痰证。方中半夏燥湿化痰，和胃消痞；陈皮理气燥湿，通气消痰；茯苓健脾渗湿祛痰；甘草健脾和中。在二陈汤的基础上加上健脾益气、燥湿利水的白术，诸药合用，共奏疏肝健脾、祛痰利湿、消积化瘀、降脂减肥之功效。

NAFLD 的发病机制复杂，越来越多学者支持NAFLD 发生发展过程的“多重打击”机制[4]。“多重打击”包括胰岛素抵抗、脂质代谢异常及肝细胞脂肪变性、氧化应激、炎症的发生等，多重因素贯穿在NAFLD 的不同发病阶段，促进NAFLD 的发生发展。其中脂质代谢异常及肝细胞脂肪变性是其最明显的特征之一，如果镜检发现肝脏组织有超过5%的肝细胞脂肪变，即可诊断为NAFLD。正常情况下，肝脏摄取血液中的游离脂肪酸后，合成甘油三酯（TG），随后以极低密度脂蛋白的形式将TG 转运出肝脏。肝细胞内多余的脂肪酸主要是以脂滴的形式存在，同时还有一部分脂肪酸被氧化产生能量。但是，在某些病理条件下出现肝细胞合成TG 增加，或转运出TG 的能力减弱，以及脂肪酸氧化异常，肝细胞就会出现大量的脂滴积累，从而造成肝细胞脂肪变。因此，通过调节肝脏的脂质代谢可以有效缓解NAFLD[22]。

沉默信息调节因子1（SIRT1）是一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶，它与基因转录沉默、脂质积累等密切相关。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一类重要的蛋白激酶，能够感知机体内能量代谢的变化，激活后能增强胰岛素的敏感性及脂肪合成等耗能过程，同时启动脂肪酸氧化、调节脂质代谢，维持肝脏糖脂代谢的平衡[23-24]。SIRT1的过表达可以激活AMPK，进而增加脂肪酸的氧化，减少葡萄糖的输出，同时减少TC、TG 的合成[25-26]。研究[27-28]表明，提高SIRT1/AMPK 通路活性有助于减少脂质堆积，改善肝脏脂肪变性。甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）由三种同型异构体包括SREBP-1a、SREBP-1c 及SREBP-2 组成，其中SREBP-1c 主要表达于肝细胞和脂肪细胞，是控制脂肪链合成和肝脏脂质生成的重要转录因子[29-30]。激活AMPK 能够下调SREBP 的表达，进而抑制参与脂肪生成相关转录因子的表达，减少脂肪酸的合成和脂质积累，改善肝脏脂肪病变[20]。因此，下调SREBP-1c 表达同样可以减轻肝脏脂肪沉积。

本研究结果显示，加味二陈汤可改善NAFLD 小鼠的体质量、肝脏系数、血脂水平、肝脂水平及肝功能，提高抗氧化能力及血糖耐受，对NAFLD 小鼠肝细胞脂质蓄积有显著改善作用，并能上调NAFLD小鼠肝组织SIRT1、AMPK 表达，下调SREBP-1c 表达。综上所述，加味二陈汤对高脂饮食诱导的NAFLD 小鼠肝脏脂质代谢有显著改善作用，其机制可能与调控SIRT1/AMPK/SREBP-1c 通路有关。