张露 尹丽明 付文金 陈甘海

颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）不仅引起中枢神经系统的损伤，还可引发多种严重并发症，具有高致死率，高致残率，预后差的特点［1］。因此，准确判断TBI 的严重程度，对于确定其预后和评估治疗中承担的风险至关重要。目前，普遍采用格拉斯昏迷指数（Grass Coma Index，GCS）评估患者严重程度，然而神经症状可能会在整个TBI 过程中持续存在，从而降低了GCS 的准确性。影像学CT、MR 尽管应用广泛，但亦存在明显异质性，即影像学的结果相似，但临床预后差异较大。而临床指南中关于TBI 诊断可使用的生物标志物有限。外泌体作为新型生物标志物，其内容物丰富、分布广泛，具有灵敏度和特异性高，半衰期长，且易于检测等特点，其为当下研究的热点［2］。研究表明外泌体miRNA在不同的细胞与组织间传递信号，广泛参与调控多种神经系统疾病［3-4］。基于此，本研究通过分析TBI 患者脑脊液和血清中的外泌体miRNA的表达为TBI 的辅助诊断提供可参考的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 TBI 患者与对照组的脑脊液样本与血清样本的收集

根据研究对象的病例资料，选择2020 年1 月至2022 年12 月于东莞市厚街医院急诊科接收颅脑损伤患者共15 例（10 例为重型，5 例为轻型），为TBI 组，其中9 例男性，6 例女性，所有患者均按照格拉斯哥昏迷指数评分（Galsgow Coma Scale，GCS）量表进行评估。收集TBI 患者入院48 h 内的样本，其中腰椎穿刺获得脑脊液样本，静脉采血获得血液样本。纳入标准：TBI 组受试者年龄18～60 岁，经头颅CT 确诊符合TBI 的诊断标准［5］，其中GCS 评分9～15 分为轻型，GCS 评分≤8 分为重型。3 分及以下多提示脑死亡及预后极差，未收集到这部分病人样本；排除标准：入院后14 天内死亡、颅脑CT 正常、既往有脑出血脑梗死的病史、出血障碍、妊娠期或哺乳期妇女及临床资料不完整的病人。另选择同期妇科、五官科和骨科的13 例志愿者为对照组，其中5 例男性，8 例女性，年龄18～60 岁。所有参与该研究的患者均已告知研究目的，并签署知情同意书。研究已通过院伦理委员会伦理审查（2020 厚医伦审第006 号）。

1.2 方法

1.2.1 外泌体的提取与纯化

分别收集TBI 患者20～25 mL 脑脊液样本与4 mL 血液样本，对照组收集4～5 mL 脑脊液样本和4 mL 血液样本，经2 000×g，离心半径为8.6 cm，离心20 min，去除细胞碎片，分装后冻存到-70℃冰箱备用。脑脊液与血清标本于4℃，3 000×g，离心半径为8.6 cm 离心20 min，取上清，按说明书（上海翌圣生物，41208ES30 和41206ES30）提取脑脊液和血清外泌体。将纯化后的外泌体于-80℃保存备用。

1.2.2 外泌体的鉴定

1.2.2.1 透射电镜鉴定外泌体的形态 吸取样品滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，在滴加10 μL 磷钨酸于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，室温干燥3 min 后置于透射电镜成像。

1.2.2.2 纳米流式检测仪分析外泌体粒径 吸取样品30 μL 于NanoFCM 仪器中检测粒径和浓度。

1.2.2.3 Western blot 检测外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101 蛋白（TGS101）、跨膜糖蛋白（CD9、CD81）和非外泌体表达蛋白钙联蛋白（Calnexin）的表达 BCA 法测定总蛋白使不同组间蛋白上样量保持一致，在SDS-PAGE 凝胶上分离并转移至PVDF 膜上、孵育特异性一抗（均为1∶1 000）4℃过夜和二抗（1∶5 000）室温1 h（抗体均来自abcam 公司）后于化学发光成像仪（BioRad）显色。

1.2.3 外泌体miRNA测序

分别选3 例sTBI 和对照组的患者脑脊液外泌体送华大基因公司进行miRNA测序。用负二项分布原理DEseq2 方法分析差异表达基因。

1.2.4 外泌体RNA 提取

按试剂盒说明书（北京天根生物科技，DP419）提取外泌体总RNA。

1.2.5 荧光定量PCR 检测差异表达的miRNA

用miRNA的特异性逆转录引物制备cDNA 模板，使用ABI QuantStudio 5 实时荧光定量仪进行qPCR 扩增，反应条件按说明书推荐的程序进行扩增；引物与扩增试剂盒均购自广州锐博生物科技有限公司。采用miRNA2-ΔΔCt计算差异基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理和分析。用Graph Pad Prism5 作图。符合正态分布的计量资料的组间比较采用t检验，呈非正太分布的计量资料采用非参数t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液中外泌体的鉴定

透射电镜下外泌体呈完整闭合性的膜性小囊泡，见图1A～1B；TBI 组和对照组的平均直径分别为75.38 nm 和73.12 nm，浓度分别为1.49×1011paritcle/mL 和4.64×109paritcle/mL，见图1C～1D。两组均检测出脑脊液中外泌体标记蛋白TGS101和CD9，未检出CD81 和Calnexin（外泌体不表达该蛋白），对照组同时检测出CD81 和Calnexin，未检出TGS101 和CD9，见图1E。

图1 TBI 组和对照组脑脊液外泌体的鉴定Figure 1 Identification of cerebrospinal fluid exosomes in TBI and control groups

2.2 外泌体miRNA 差异表达分析

选择3 例重型颅脑外伤患者（severe traumatic brain injury，sTBI）和3 例对照组的外泌体进行miRNA测序。样本相关性分析结果显示sTBI2样本呈现离群状态。见图2A。排除该样本的聚类分析结果。见图2B。负二项分布原理DEseq2方法分析差异表达结果显示，脑脊液外泌体中共8 个miRNA差异表达，其中2 个表达上调包括miR-29a-3P、miR-31-5P，6 个表达下调包括miR-199a-5P、miR-10a-5P miR-219a-2-3P、novelhsa-miR181-3p、novel-hsa-miR235-3 p 和novel-hsamiR293-5p。见表1。对8 个差异表达miRNA的靶基因进行GO 和KEGG 富集分析，GO 结果显示差异miRNAs靶向的mRNAs主要富集在核染色质，细胞连接、核浆中等相关通路上，而KEGG 数据库以轴突导向通路、神经营养素信号通路、粘多糖生物合成-乙酰肝素通路等为主。见图2C～2D。

表1 脑脊液外泌体差异表达的miRNATable 1 Differentially expressed miRNAs in cerebrospinal fluid exosomes

图2 脑脊液外泌体miRNA 的测序结果Figure 2 Results of cerebrospinal fluid exosome miRNA sequencing

2.3 脑脊液与血清中验证差异表达的miRNA

TBI 组（n=15 例）中脑脊液外泌体中的miR-29a-3P为对照组（n=12 例）的2.33 倍，差异有统计学意义（t=3.603，P＜0.05），与测序结果一致。见图3A。miR-31-5P为对照组的2.05倍，差异有统计学意义（t=2.273，P＜0.05），与测序结果一致。见图3B。miR-199a-5P为对照组的0.32 倍，差异无统计学意义（t=0.099，P＞0.05），与测序结果不一致。见图3C。

图3 TBI 组和对照组脑脊液和血清外泌体差异表达的miRNAFigure 3 Differentially expressed miRNAs in cerebrospinal fluid and serum exosomes in the TBI and control groups

TBI 组（n=11例）中血清外泌体中的miR-29a-3P为对照组（n=13 例）的1.95 倍，差异有统计学意义（t=2.110，P＜0.05）。见图3D。miR-31-5P为对照组的2.01 倍，差异有统计学意义（t=2.309，P＜0.05）。见图3E。miR-199a-5P为对照组的0.34 倍，差异有统计学意义（t=2.825，P＜0.05）。见图3F。

3 讨论

颅脑损伤的严重程度往往取决于继发性损伤，即指初级损伤后伴随各种病理生理反应如脑水肿、颅内压升高、血脑屏障破坏等神经功能紊乱等导致神经元死亡［1，6］。因此，准确判断颅脑损伤的严重程度，对于确定其预后和评估治疗中承担的风险至关重要。然而，现临床针对TBI 诊断方法的均存在不足，由于患者入院24 小时内需给予镇静剂类药物，干扰GCS 测量，无法对损伤做出准确的反应。CT 扫描存在的灵敏度不够及辐射等不良反应，MRI 不能用于由金属碎片导致患者损伤［7-9］。外泌体是一种新型生物标志物，在循环体液中有较好的稳定性，其脂质结构使其具有透过生物屏障的能力，例如血脑屏障，这就促使外泌体在神经系统疾病的诊断、治疗［10-11］即基因和药物输送方面的研究越来越多。因此，本篇通过测序技术筛选可辅助诊断TBI 生物标志物，用于评估疾病严重程度。由于脑脊液相较于其他体液更准确地反映TBI 引起的大脑改变［12-13］，研究报道与血清相比，TBI 后脑脊液中IL-6 水平等炎症标志物与脑组织损伤的神经生化标志物S100B 表达更早出现且明显高，这提示脑脊液样本对于TBI 的辅助诊断可能有更大的价值，因此本研究选择收集脑脊液样本，进行外泌体miRNA测序。脑脊液样本难以获取，主要是部分颅脑损伤患者存在脑脊液检验禁忌症、取样操作难度大等原因。因此，除了脑脊液样本，同时收集了血清样本进行验证，通过比较测序结果是否与脑脊液和血清验证结果的一致获得有意义的生物标志物。

对照组脑脊液外泌体浓度低，故将三个脑脊液标本混匀后按一个样本处理，针对外泌体的鉴定中出现了非特异性蛋白Calnexin 的干扰，而特异性蛋白较少，未检出TGS101 和CD9，但其电镜分析与粒径分析均实可从脑脊液中提取到外泌体。从粒径分析结果可见，颅脑损伤后脑脊液中外泌体释放明显增加。根据测序结果及验证结果可见，脑脊液和血清外泌体的miR-29a-3P 和miR-31-5P均与测序结果一致，表达上调约2 倍，且差异有统计学意义，有潜力作为辅助诊断TBI 的生物标志物。虽脑脊液和血清外泌体中miR-199a-5P与测序结果变化一致，表达下调约为0.3 倍，但差异无统计学意义。其可能的原因是验证样本中的颅脑损伤患者包括了轻型和重型患者，且样本量少，使得结果差异倍数较小，组内样本变异较大。有研究构建了TBI 动物模型［14］，通过注射miR-29a-5p和miR-29a-3p模拟物，发现miR-29a-5p和miR-29a-3p通过抑制NLRP3 表达和激活，对TBI 诱导的内皮细胞通透性增加和血脑屏障功能障碍发挥保护作用，而本篇结果发现TBI 后的外泌体中miR-29a-3p上调，可能原因是miR-29a-3p存在应激性表达上调。Siqi Wang 等［15］构建小鼠创伤性脑损伤后lncRNA相关竞争性内源性RNA 调控网络，发现TBI 小鼠大脑皮层组织中mmu-miR-31-5p表达下调，与本篇结果相反，推测miR-31-5p可能存在种属差异。未见文献报道过miR-199a-5P与TBI 的相关研究。

综上，外泌体中miR-29a-3P和miR-31-5P有潜力作为辅助诊断TBI 的生物标志物。但本文尚需扩大样本量，进一本证实该结果并深入探讨miR-29a-3P和miR-31-5P可能作用与下游mRNA可能发挥作用的机制。