彭远远 包训迪 徐东芳

结核病是由兼性细胞内致病菌结核分枝杆菌感染引起的常见慢性疾病，对公众健康构成严重危害。根据世界卫生组织的调查和评估，全世界每年约有2 000 万结核病新发病例，世界上近1/3 的人口处于潜伏感染状态［1］。3 次痰涂片且痰培养均呈阴性则可诊断为菌阴肺结核，其属于非活动性肺结核。但目前痰涂片抗酸染色法仍存在要求样品中的细菌含量高、阳性率低、敏感性和特异性不高等不足，导致误诊、漏诊等情况时有发生，使得结核病的控制难度加大［2］。因此，提高菌阴肺结核的阳性诊断率，以控制结核病进展具有重要意义。涂片抗酸染色法是临床确诊结核病的常用方法，结核感染T 细胞斑点试验（T-cell spot of tuberculosis assay，T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert MTB/RIF）是近年来结核分子检测的新型工具。越来越多的证据表明［3-4］，T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 可以有效诊断结核分枝杆菌感染，并且具有相对较高的敏感性和特异性。但关于涂片抗酸染色T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 联合诊断菌阴肺结核相关报道较少。本研究主要探究涂片抗酸染色、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF 联合检测在菌阴肺结核中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

分析2021 年1 月至12 月期间安徽省胸科医院102 例疑似菌阴肺结核患者的住院资料及临床标本（支气管肺泡灌洗液）检测结果。纳入标准：①疑似肺结核是指患者有结核相关症状（发热、乏力、胸痛、咳嗽、盗汗、体重减轻、咳痰）和符合活动性肺结核的异常肺部影像学证据（肺浸润、纤维结节病变和空洞性病变）［5］。菌阴肺结核诊断符合中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断WS288-2017》［6］中的诊断标准，时痰、夜间痰、晨痰3 次痰涂片且痰培养均呈阴性，抗结核治疗有效，不符合此诊断标准的患者则纳入非菌阴肺结核组；②年龄18～70 岁；③病历及检测报告完整，并接受涂片抗酸染色、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF 检测。排除标准：①无法采集标本或采集量不足难以进行检测；②标本培养结果判定为污染；③陈旧性肺结核或近期应用过抗结核药物；④合并肿瘤或自身免疫性疾病。所有患者均签署知情同意。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 检验方法

1.2.1 涂片抗酸染色

取干净容器收集清晨支气管镜检灌洗液，离心浓缩，组织标本经无菌研磨后取组织匀浆涂片，经紫外线照射30 min 后采用萋-尼法染色，载玻片干燥后油镜下（100×）观察结果［7］。

1.2.2 T-SPOT.TB

采集患者外周静脉血样本5 mL 置于肝素锂抗凝管中，4 h 内分离外周单个核细胞以制备细胞悬液。采用结核感染T 细胞检测试剂盒（英国Oxford Immunotec Ltd.公司）进行如下操作：将细胞悬液接种到T-SPOT 上。TB 平板并分别与早期分泌抗原靶6（early secretory antigenic target 6，ESAT-6）、培养滤液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP10），阳性对照或阴性对照孵育。然后将100 μL 细胞悬液加入相应的微孔培养板中，5%CO2，37℃培养过夜。然后用磷酸盐缓冲溶液洗涤微孔四次，将50 μL 二抗溶液加入每个孔中，1～2℃孵育8 小时。最后加入50 μL 显色剂，避光下处理板7～12 min。完成后计算斑点数，一个斑点代表一个可以分泌特异性细胞因子的T 细胞。最终判定结果符合以下标准［8］：在两种情况下结果判定为阳性：①阳性对照表现正常，若阴性对照组中的斑点数＜6，且CFP-10 或ESAT-6 孔中的斑点数-阴性对照中的斑点数≥6 个。②若阴性对照组的斑点计数为6～10，且CFP-10 或ESAT-6 斑点数≥2×阴性对照组斑点数。若斑点数不符合上述标准，则结果为阴性。

1.2.3 GeneXpert MTB/RIF

该操作严格按照GeneXpert MTB/RIF 系统统（美国Cepheid 公司）的操作说明进行。将6 mL 支气管镜检灌洗液与治疗溶液以1∶2 的比例充分混合。消化和处理15～20 min 后，用取样枪吸入2 mL 反应混合物，然后缓慢放入反应盒中。然后将箱子放入检测模块进行后续反应：（Ⅰ）样品自动清洗过滤，（Ⅱ）超声裂解后，形成DNA 片段并纯化，（Ⅲ）DNA 与PCR 试剂反应，（Ⅳ）半巢式实时荧光定量核酸扩增检测。系统可自动判读待测样本是否检出结核分枝杆菌复合群及利福平的耐药情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS Statistics 23.0 统计学软件进行分析。不符合正态分布的计量资料，采用中位值（上四分位数、下四分位数）表示，组间差异采用Man-Whitney U 检验；符合正态分布的计量资料以（）表示，组间采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验，以检出率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值描述各检测方法的诊断效能。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

根据最终诊断，67 例菌阴肺结核患者纳入菌阴肺结核组，其余35 例患者纳入非菌阴肺结核组。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组患者一般资料比较［（），M（P25，P75）］Table 1 Comparison of general data of two groups of patients［（），M（P25，P75）］

表1 两组患者一般资料比较［（），M（P25，P75）］Table 1 Comparison of general data of two groups of patients［（），M（P25，P75）］

2.2 两组涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 结核分枝杆菌检出情况

菌阴肺结核组涂片抗酸染色、T-SPOT.TB、GeneXpertMTB/RIF 的肺泡灌洗液检出率分别为11.94%、50.75%、55.22%。非菌阴肺结核组涂片抗酸染色、T-SPOT.TB、GeneXpertMTB/RIF 的肺泡灌洗液检出率分别为28.57%、42.86%、48.57%。T-SPOT.TB、GeneXpertMTB/RIF 的检出率均高于涂片抗酸染色，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 结核分枝杆菌检出情况（%）Table 2 Acid fast staining，T-SPOT.TB and GeneXpert MTB/RIF detection of Mycobacterium tuberculosis in two groups of smears（%）

2.3 涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 对菌阴肺结核的诊断性能

以临床最终诊断结果为金标准涂片抗酸染色、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF 三种方法联合检测的灵敏度高于三者单独检测（P＜0.05）。见表3。

表3 涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 对菌阴肺结核的诊断性能Table 3 The diagnostic performance of smear acid-fast staining，T-SPOT.TB and GeneXpert MTB/RIF for bacterial negative pulmonary tuberculosis

3 讨论

结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道、血液接触等途径传播至各种组织和器官，被认为是结核病发生的关键感染源［9］。全世界每年约有1 200 万人死于结核病，其中近2 000 万新发病例，我国仍是全球结核病高负担国家中的一员。目前，由于老年患者、免疫损害患者的增多和结核分枝杆菌耐药性的增加，结核病特征往往被并发症等症状所掩盖，导致临床检查出现误诊、漏诊或治疗延迟，传播几率大大增加［10］。因此，尽早预防、快速准确地诊断和治疗是控制结核病进展的重要措施。

涂片显微镜检查和培养通常用作实验室检测结核分枝杆菌的常规方法。涂片抗酸染色的基本原理是通过Ziehl-Neelsen 染色（ZNS）识别涂片中的抗酸杆菌，其具有检测速度快、易于普及等优点，但它要求样品中的细菌含量高，导致灵敏度低。本研究结果提示涂片抗酸染色不适用于菌阴肺结核支气管肺泡灌洗液的单独诊断，这与刘桂治等［11］的研究结果相符。这可能是因为支气管肺泡灌洗液中的细菌含量不高，导致低杆菌负荷病例无法检出。T-SPOT.TB 是基于受分枝杆菌特异性抗原刺激的结核分枝杆菌特异性T 细胞中分泌的IFN-γ，并联合酶联免疫斑点技术检测是否感染结核的免疫学方法。其不受患者排菌状态、排菌数量的影响，灵敏度高；且不与环境分枝杆菌、卡介苗发生交叉反应。本研究中，T-SPOT.TB 的检测灵敏度为58.71%，与Sun 等［12］报道相比灵敏度略低，造成这种差异的原因可能是地区、研究样本总数的不同。Gene Xpert MTB/RIF 是一种由世界卫生组织推荐临床检测结核病的半巢式实时荧光PCR 检测方法。其具有较高的灵敏度和特异度，操作简单，耗时短（仅需2 h），检测过程安全，自动化，且不易受外界因素干扰，临床上已广泛应用于痰与灌洗液标本的检测。本研究结果显示，Gene Xpert MTB/RIF 的诊断菌阴肺结核的敏感度为71.64%，特异度为88.57%。Zhang 等［13］的研究表明，GeneXpert 方法在单一方法中表现出最高的特异性和敏感度，分别为99.08%和96.95%，并建议联合检测可进一步提高敏感性。赵丽等［14］也采用涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 对疑似肺结核患者进行诊断，结果发现Gene Xpert MTB/RIF 的准确率（89.9%）、特异度（100.0%）和阳性预测值（100.0%）最高，T-SPOT.TB 或Gene Xpert MTB/RIF 检测的灵敏度显著高于涂片法，这与本研究的结论一致。另有研究表明［15］，采用T-SPOT.TB 或Gene Xpert MTB/RIF 联合涂片法均可显著提高结核病诊断的灵敏度。T-SPOT.TB 和Gene Xpert MTB/RIF 还具有快速检测的特性，可大大缩短检测时间。

综上，支气管肺泡灌洗液应用涂片抗酸染色、T-SPOT.TB 与GeneXpert MTB/RIF 联合检测对菌阴肺结核患者诊疗具有重要价值，可较快分析结果，有效提高菌阴肺结核的诊断准确率，预期可协助临床抗病原微生物治疗方案的制定，遏制结核感染性疾病的传播。既往研究指出，受试者的免疫状态可能会影响T-SPOT.TB、GeneXpertMTB/RIF 的检测结果。本研究的局限性在于本研究未考虑T 细胞活性、营养状况、其他并发症以及吸烟和饮酒等与患者免疫状态相关的因素，可能使结果产生一定的偏倚。