于金萍,张 惟,李 琦,白鹏华,崔新仪,刘亦学

(1.天津农学院,天津 300384;2.天津市农业科学院 植物保护研究所,天津 300381)

小麦是世界主要粮食作物之一,其种植面积仅次于水稻[1]。小麦的稳产、高产、轻简化栽培及小麦品质与国家粮食安全和社会稳定有着密切的联系[2-5]。近年来,随着新型耕作和施肥制度等的持续推广,小麦田禾本科杂草发生蔓延速度加快,严重影响小麦产量,增加小麦种植成本[6-9]。因此,田间简化杂草防治技术的研究成为科研人员关注的重点问题。

目前,麦田中阔叶杂草及部分禾本科杂草防治较为简单,使用异丙隆[10-11]、吡氟酰草胺[12]、氟噻草胺[13]和炔草酯[14]等常用麦田除草剂即可防治。但是,田间野燕麦、雀麦、节节麦和大穗看麦娘等杂草,由于和小麦亲缘关系较近,基因同源性高且代谢途径相近,使用常规麦田除草剂无法有效防除上述杂草,导致近年来近缘杂草蔓延迅速,逐渐成为麦田主要恶性杂草,严重影响小麦的生长,造成小麦减产甚至绝产[15-18]。上述小麦近缘杂草防治困难,增加了小麦田间杂草的防治成本。因此,亟待挖掘、创制能够抵御灭生性除草剂的小麦资源,轻简化小麦田间杂草有效防治技术,且不影响小麦产量,降低小麦种植的人工投入和种植成本,增加小麦产品在国际市场的竞争力。前人研究表明,咪唑乙烟酸能够有效防治一年生禾本科杂草马唐、稗草以及阔叶杂草苍耳等[19];烟嘧磺隆常用于防除玉米田中一年生杂草[20]。大部分谷子栽培种及野生近缘种均不能抵御咪唑乙烟酸和烟嘧磺隆,但经育种创制的冀谷32和冀谷33却能够有效抵御咪唑乙烟酸及烟嘧磺隆[19,21],于是在谷子种植生产中形成了“(抗除草剂)冀谷+除草剂”的杂草防治模式。基于抗草铵膦bar基因和pat基因的研究与应用,目前,已经发现、创制了抗草铵膦大豆、玉米、油菜、甜菜、棉花等材料[22-24],而发展“灭生性除草剂+抗除草剂作物”是现代农业可持续发展的新模式。

草铵膦(Glufosinate-ammonium)是通过抑制谷氨酰胺合成的有机磷类除草剂,能够灭生性的杀死小麦、节节麦、燕麦、雀麦[25]等绝大部分绿色植物。因此,创制抗草铵膦小麦新种质是有效控制小麦野生近缘杂草,实现“抗除草剂资源+草铵膦”的新型轻简化栽培技术的有效手段。创制材料的根本在于研究草铵膦在小麦中的代谢信号通路,挖掘关键基因,并利用、改造基因。目前,转录组测序技术(RNA-seq)是高效挖掘相关基因的常规手段,已经在小麦耐盐基因挖掘、抗旱基因挖掘中发挥重要作用[26-28]。

本研究通过对草铵膦处理苗期小麦的表型鉴定,筛选用于RNA-seq样本处理的浓度及时间。利用RNA-seq对基因表达量进行分析,挖掘关键差异表达基因,并通过隐马尔可夫(HMM)算法等相关生物信息学技术挖掘关键基因家族成员,明确该基因家族在小麦染色体中分布情况及表达模式,从而为后续解析关键基因功能,利用基因编辑手段改造并利用基因提供有效信息,为创制抗除草剂种质资源提供理论基础及技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料及小麦植株处理

供试小麦品种为春小麦津强11号和冬小麦津农6号,由天津市农业科学院农作物研究所提供。小麦种子经 75%乙醇表面消毒3～4 min,并用蒸馏水冲洗4～5次,置于有2层湿润滤纸的培养皿中,在24 ℃黑暗条件下培养至萌发,然后播种至盛有营养土的塑料盆中(直径10 cm),播种深度3～5 cm,每盆播种10粒,播种后转至人工气候箱光照培养(16 h光照/8 h黑暗)。

200 g/L草铵膦水剂由浙江新安化工集团股份有限公司提供。为了筛选用于RNA-seq样本处理的浓度及时间,利用草铵膦于小麦植株三叶一心时进行茎叶喷雾处理。草铵膦使用浓度选取市场推荐用量(1 740 g/hm2)的1倍浓度(1×,1 740 g/hm2)、2倍浓度(2×,3 480 g/hm2)、3倍浓度(3×,5 220 g/hm2)和4倍浓度(4×,6 960 g/hm2),兑水量为450 L/hm2,在处理的0,3,9,12 h进行小麦的表型观察。

1.2 转录组测序

应用TIANGEN公司RNA提取试剂盒(DP762-T1A)提取总RNA,由上海派森诺生物科技有限公司采用Illumina NovaSeq测序平台进行转录组测序。转录组原始数据处理与质控样品经过上机测序,得到图像文件,由测序平台自带软件进行转化,生成FASTQ的原始数据(Raw Data),即下机数据。对每个样品的Raw Data分别进行统计,包括样品名、Q20、模糊碱基所占百分比。测序数据包含一些带接头、低质量的reads,这些序列会对后续的信息分析造成很大的干扰,因此需要对测序数据进行进一步过滤。数据过滤的标准主要包括:①采用Cutadapt去除3′端的接头,去除的部分与已知接头有至少10 bp Overlap;②去除平均质量分数低于Q20的reads。

1.3 比对分析

使用TopHat2的升级版HISAT2(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)软件将过滤后的reads比对到参考基因组(https://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)上,采用基因覆盖均一度、饱和度分析对测序质量以及测序数据量进行评估。

1.4 表达量分析

使用HTSeq(0.9.1)统计比对到每一个基因上Read Count值,作为基因的原始表达量。reads计数与基因的真实表达水平,以及基因的长度和测序深度呈正相关。为了使不同基因、不同样本间的基因表达水平具有可比性,采用FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)对表达量进行标准化,FPKM是每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目,对于Pair-End测序,每个Fragments会有2个reads,FPKM只计算2个reads能比对到同一个转录本的Fragments数量。

1.5 差异表达基因分析

转录组主要目的是寻找不同比较组之间的差异基因,以揭示导致比较组之间不同的分子机制。采用 DESeq(1.39.0)软件包对基因表达进行差异分析[29],筛选差异表达基因条件为:表达差异倍数|log2FoldChange|>1,显著性P-value<0.05。

1.6 生物信息学分析

用DNAman 8.0进行核苷酸序列比对[30];通过HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools)预测氨基酸结构域,采用HMM算法通过HMMER软件进行全家族成员调取,并使用mapchart进行染色体定位可视化[31],使用TBtools进行序列统计分析及可视化[32]。

2 结果与分析

2.1 草铵膦处理苗期小麦表型鉴定

由图1可知,随着草铵膦溶液浓度升高,小麦叶片受到胁迫逐渐增强。叶片出现萎蔫、失绿等坏死症状的时间随浓度升高而缩短。随着处理时间的延长,小麦幼苗逐渐死亡。在1×、2×和3×草铵膦溶液处理下,药后3,9 h小麦表型变化差异不大。4×草铵膦溶液处理后3,9 h的表型差异明显,12 h下叶片均枯萎。由于干枯死亡的叶片RNA含量少,且完整性差,不适宜进行RNA提取及转录组测序,因此,选择4×草铵膦溶液处理小麦0,3,9 h后的叶片进行转录组测序,挖掘与草铵膦胁迫密切相关的基因。

2.2 草铵膦胁迫基因挖掘

由于冬小麦种植面积远高于春小麦,因此,选用冬小麦津农6号进行基因挖掘研究。以草铵膦处理前(0 h)的小麦幼苗为对照,对处理3,9 h的转录组数据进行差异基因分析。结合小麦基因组注释信息,发现TraesCS4A02G044000基因在草铵膦处理津农6号后受到诱导,上调表达显著;该基因表达量在草铵膦处理3,9 h后分别提升4.3,16.7倍(图2),且持续增加,说明该基因在抵御草铵膦胁迫过程中起到重要作用。

进一步序列分析表明,TraesCS4A02G044000基因长度为1 975 bp,位于小麦第4同源群A基因组。TraesCS4A02G044000定位于4A上的36 611 408～36 614 890 bp的反义链上(表1)。该基因存在1个内含子和2个外显子,编码序列长度1 155 bp,能够编码长度为384 aa的蛋白(图3-A)。蛋白结构域分析表明,该基因编码的蛋白存在1个信号肽、1个DUF568结构域和1个b561结构域。DUF568结构域位于88～186 aa,功能未知;b561结构域位于204～333 aa,参与细胞色素形成(图3-B)。

表1 TraesCS4A02G044000家族成员Tab.1 Family members of TraesCS4A02G044000

A.TraesCS4A02G044000基因序列结构图;B.TraesCS4A02G044000基因编码蛋白结构域(蛋白结构域由信号肽、DUF568、b561组成)。A. Sequence structure of TraesCS4A02G044000; B. Protein domain of TraesCS4A02G044000 encoded (protein domain consists of signal peptide, DUF568 and b561).

2.3 TraesCS4A02G044000及其家族成员分析

由以上分析可知,TraesCS4A02G044000基因编码的氨基酸含有1个DUF568结构域和1个b561结构域,需在小麦基因组挖掘该基因所在家族的全部成员中既含有DUF568结构域也含有b561结构域的基因。结果在小麦中发现了34个含有DUF568结构域的基因,55个含有b561结构域的基因,其中,12个基因成员同时含有DUF568结构域和b561结构域。

进一步分析12个成员在染色体的位置,发现该家族成员位于第4,5,7同源群,TraesCS4A02G044400等6个成员来自第4同源群,TraesCS5A02G278800等3个成员来自第5同源群,TraesCS7A02G255600等3个成员来自第7同源群(表1)。

2.4 TraesCS4A02G044000及其家族成员进化分析

聚类分析表明,上述12个成员分别属于4个基因,TraesCS4D02G265500、TraesCS4B02G265500、TraesCS4A02G044400为1个基因在A、B、D染色体的同源基因;TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100、TraesCS4A02G044000属于同一个基因;TraesCS7B02G152000、TraesCS7A02G255600、TraesCS7D02G254000属于同一个基因;TraesCS5B02G278100、TraesCS5D02G285700、TraesCS5A02G278800属于同一个基因。通过差异表达基因分析筛选出的草铵膦胁迫处理小麦幼苗后上调基因为TraesCS4A02G044000,其位于第4,5,7同源群的聚类在一起,与第4同源群的另外1个基因关系相对较远(图4)。

图4 TraesCS4A02G044000及其家族成员聚类分析Fig.4 Cluster analysis of TraesCS4A02G044000 family members

为了进一步研究3组同源基因群是否受到草铵膦胁迫处理的影响,分析了12个基因在草铵膦胁迫下的表达模式。结果发现,位于第4同源群A、B、D染色体的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草铵膦胁迫处理下显著上调表达,说明该3个基因表达量受到草铵膦胁迫诱导显著,参与了小麦耐草铵膦胁迫(图5)。

图5 TraesCS4A02G044000家族成员在草铵膦胁迫处理下的基因表达模式分析Fig.5 Gene expression pattern analysis of TraesCS4A02G044000 family members under glufosinate-ammonium stress

3 结论与讨论

小麦是异源六倍体植物,基因组大而且复杂,重复序列多[33]。因此,从小麦自身研究出发,通过草铵膦胁迫处理,比较不同时间处理后的差异表达基因,揭示小麦参与草铵膦胁迫的特定分子机制,为进一步筛选抗草铵膦相关基因提供理论依据。本研究筛选出用于转录组测序的草铵膦处理苗期小麦的浓度(4×,6 960 g/hm2)和时间(0,3,9 h),对转录组的表达量进行统计,经标准化处理、筛选后发现,TraesCS4A02G044000基因受到草铵膦胁迫的显著诱导;在此基础上进一步分析了该基因编码蛋白的结构域,并用保守结构域调取小麦中的全家族成员,进而分析该家族在抗草铵膦中的潜在作用。

结构域分析发现,从该基因家族中调取的12个成员都存在DUF568结构域和b561结构域。DUF568结构域在植物中功能未知,可在今后重点研究,从而解析该结构域如何在抗草铵膦中发挥作用。前人研究表明,细胞色素b561在植物中成员众多[34],b561结构域是细胞色素b561(Cyt B561)的典型结构域,细胞色素b561是高等植物的质膜(PM)中存在一种特定的高电位、抗坏血酸还原的b型细胞色素[35-36]。研究表明,细胞色素b561可能构成了一类新的跨膜电子传递蛋白,存在于多种真核细胞中[37]。位于细胞膜上的膜蛋白,在跨膜信号传递过程中扮演着不可或缺的角色,可感受外界刺激并将此刺激向细胞内部传递,从而调控植物响应外界的环境刺激。草铵膦的作用机理之一是促进铵离子大量累积,导致细胞膜内外离子平衡遭到破坏[38]。因此,基于b561可能构成新的跨膜电子传递蛋白的潜在功能和草铵膦引起的离子浓度失衡,本研究推测喷施草铵膦的植株某些跨膜传导系统受到了一定的破坏。因而,电子信号传递的重要因子细胞色素b561可能在抵御草铵膦中发挥作用,或者是草铵膦破坏了电子信号传导,从而引发了细胞色素b561编码基因表达水平的改变。因此,无论细胞色素b561和草铵膦是何种关系,细胞色素b561都可能是调节植物抵御草铵膦胁迫的重要候选因子,可通过基因编辑,敲除细胞色素b561编码基因,深入研究该因子的功能。

通过基因表达模式分析发现,位于第4同源群A,B,D染色体的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草铵膦胁迫下显著上调,说明该3个基因表达量受到草铵膦胁迫诱导,参与小麦耐草铵膦胁迫。上述12个基因家族成员,是否存在功能冗余,或成员之间是否协同发挥作用还未可知。目前,随着小麦泛基因组及大量重测序数据的公布,在今后明确上述基因具体功能的基础上,研究基因的自然变异情况,在育种中深度利用优异等位基因,从而利于抗草铵膦育种水平的提升;实现灭生性除草剂在小麦田间控制小麦野生近缘杂草,从而解决小麦田禾本科杂草控制难,生产成本高的现状。