倪沁雨 林佳成 涂天智 赵如意 孔晓妮 朱晓骏

1.上海中医药大学附属曙光医院中心实验室 (上海, 200021) 2.上海中医药大学附属曙光医院肝病科 3.科兴生物制药股份有限公司

肝纤维化是发生在大多数慢性肝病中的一种病理变化,其主要表现为肝组织细胞外基质(ECM)过度增殖和沉积,促使肝组织结构异常改变,影响肝脏正常生理功能[1],其病因有病毒、毒素、药物、乙醇或胆汁淤积等。肝纤维化最终可能导致肝硬化、肝癌,是肝硬化和肝癌发展过程中的重要过程。中药复方治疗肝病具有成分多、靶点多的优势且疗效好、不良反应小,且已有临床效果较好的中成药在临床上使用[2]。

克癀胶囊是保肝退黄的常用中成药,其成分为三七、黄连、黄芩、黄柏、大黄、白花蛇舌草、山银花、蛇胆汁、人工牛黄、皂角刺、人工麝香、冰片、郁金、防风、石菖蒲、甘草,共16味,具有清热解毒,化瘀散结的功效,适用于胁肋胀痛或刺痛,胁下痞块,口苦口黏,纳呆腹胀,面目黄染,小便短赤,舌质黯红或瘀斑、瘀点,舌苔黄腻,脉弦滑或涩等湿热毒邪内蕴、瘀血阻络证肝纤维化。临床研究发现克癀胶囊对于慢性乙型肝炎、胆汁淤积性肝炎、病毒性肝炎引起的高胆红素血症等具有良好疗效,临床研究发现克癀胶囊治疗6个月后,与对照组相比较,乙型肝炎肝硬化代偿期患者肝脏瞬时弹性扫描仪肝脏硬度值明显下降,由此本研究推测克癀胶囊可能具有抗肝纤维化的作用[3-8]。

网络药理学是通过构建“药物-基因-疾病”网络系统,从整体层面揭示药物对疾病的作用机制[9]。本研究采用网络药理学方法,克癀胶囊治疗肝纤维化的作用机制进行系统研究,为克癀胶囊的临床应用和进一步研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验验证

1.1.1 动物 6周龄雄性C57BL/6J小鼠 20只,体质量(20±2)g,购买于上海杰思捷实验动物有限公司。所有动物均饲养在温度( 24±1)℃ 、湿度 55%～65%、 光暗12 h交替的安静环境,自由取食及饮水。

1.1.2 药品与试剂 CCl4(麦克林公司),橄榄油(国药试剂公司),克癀胶囊(深圳同安药业有限公司),总RNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司),SYBR RT-PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机(德国Leica公司),光学显微镜(日本尼康公司),SpectraMax iD5酶标仪酶标仪(美谷分子仪器公司),AB17900PCR荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.1.4 分组、造模与给药 将20只6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组,每组5只,分别为对照组(NCD)、模型组(CCl4)、克癀胶囊低剂量组(CCl4+KH_Low)(克癀胶囊1.8 g/kg)、克癀胶囊高剂量组(CCl4+KH_High)(克癀胶囊5.4 g/kg)。除空白组外,其余各组小鼠腹腔注射10% CCl4橄榄油溶液(1 ml/kg)诱导肝纤维化模型,每周3次,共注射6周。第4周开始,CCl4+KH_Low组、CCl4+KH_High组小鼠每天给予克癀胶囊灌胃方式给药,NCD和CCl4组小鼠给予同等体积生理盐水,共给药3周。

1.1.5 样本的取材及处理 末次给药后,所有小鼠禁食不禁水12 h后,将小鼠后颈椎脱臼,取部分肝组织用4%的多聚甲醛溶液固定,其余肝脏冻存于-80℃医用低温保存箱备用。

1.1.6 RT-qPCR法检测小鼠肝组织α-SMA、COL1A1、TGF-β1 mRNA表达 称取少量冻存肝组织, 经RNA吸附柱提取总RNA,按照反转录试剂盒的操作说明书将总RNA反转录成cDNA,采用SYBR Green 进行两步法实时荧光定量PCR反应,β-actin作为内参基因, 以2-ΔΔCT分析计算各组小鼠mRNA表达情况。引物序列见表1。

表1 α-SMA、COL1A1、TGF-β1引物序列

1.1.7 肝组织病理学观察 取上述经4%的多聚甲醛溶液固定的肝组织后,石蜡包埋,切片,厚度5 μm,分别进行HE染色和天狼星红染色,通过光学显微镜观察各组小鼠肝组织结构病理变化和胶原纤维沉积情况,并拍照分析。

1.2 克癀胶囊药物有效成分与靶点 分别以三七、黄连、黄芩、黄柏、大黄、白花蛇舌草、山银花、蛇胆汁、人工牛黄、皂角刺、人工麝香、冰片、郁金、防风、石菖蒲、甘草16个中药名为关键词,通过中药系统药理学分析平台TCMSP和HERB数据库检索其所有的化学成分。在TCMSP中以口服生物利用度(OB)>30% 和类药性(DL)>0.18 作为筛选条件,收录符合条件的有效成分及对应靶点,并通过UniProt 数据库将靶点名称转换为基因名称,将其结果与HERB数据库检索结果合并去重。再用Genecards数据库进行二次筛选并获取作用靶点;Uniprot蛋白质数据库进行靶点验证,最后获得克癀胶囊的药物成分靶点。

1.3 肝纤维化相关靶点 以“hepatic fibrosis”为检索词在GeneCards数据库和DisGeNET数据库中检索疾病相关靶点,将其结果取交集,得到肝纤维化的疾病相关靶点。

1.4 GO及KEGG富集分析 利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8网站工具(https://david.ncifcrf.gov/),将潜在作用靶点进行GO分析[包括生物功能(BP),细胞组成(CC),分子功能(MF)]和KEGG通路富集分析,并用微生信网站工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行GO分析和KEGG富集分析绘图。

1.5 PPI网络构建和核心靶蛋白确定 使用Bioinformatics &Evolutionary Genomics网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),将克癀胶囊药物成分靶点与肝纤维化疾病靶点分别导入,绘制韦恩图,得到克癀胶囊对肝纤维化的潜在作用靶点。将潜在作用靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/), 限定物种为“Homo sapiens”,minimum required interaction score≥0.9,同时去掉游离的靶点,获取潜在作用靶点的蛋白-蛋白互作(PPI)网络。将PPI网络导入 Cytoscape_v3.9.0软件,利用插件cytoHubba ,用degree值法筛选出排名前20的靶点,可认为是核心作用靶点。

2 结果

2.1 克癀胶囊对肝纤维化小鼠肝脏组织α-SMA和COL1A1、TGF-β1 mRNA的表达影响 见图1。

图1 RT-qPCR法检测小鼠肝脏肝纤维化相关mRNA表达 与NCD相比,#P<0.001;与CCl4相比,#P<0.001,*P<0.05;与CCl4+KH_Low相比,#P<0.01

2.2 克癀胶囊对肝纤维化小鼠肝脏形态及病理学组织的影响 HE染色结果显示,NCD小鼠肝组织结构正常,完整清晰,肝细胞大小均匀,无变形坏死,细胞核居于细胞中央;CCl4组小鼠肝细胞排列紊乱,肝组织结构损伤严重;CCl4+KH_Low组和CCl4+KH_High组小鼠肝细胞变性、坏死等现象较CCl4组显著改善(图2A)。

图2 各组小鼠肝纤维化肝组织HE染色(A)及天狼星红染色(B)(200×) 与NCD相比,*P<0.01;与CCl4组相比,*P<0.01;与CCl4+KH_Low组相比,*P<0.001

天狼星红染色结果显示,NCD小鼠肝组织细胞结构完整,未见明显的胶原纤维沉积;CCl4组小鼠肝组织中可明显观察到大量的胶原纤维沉积;与CCl4组相比,CCl4+KH_Low组和CCl4+KH_High组小鼠肝组织中胶原沉积得到明显改善(P<0.01),且CCl4+KH_High组的效果均优于CCl4+KH_Low组(P<0.01)(图2B)。

2.3 克癀胶囊潜在有效成分与肝纤维化潜在靶点 通过检索得到克癀胶囊药物组成成分39个,见表1。其中多药共有成分12个,甘草8个,大黄、黄柏各3个,黄芩、牛黄、三七、皂角刺各2个,冰片、山银花、蛇胆汁、麝香、石菖蒲各1个。查询克癀胶囊各有效成分对应靶点,合并去重后得到靶点242个,肝纤维化疾病靶点974个,二者共有靶点90个,即克癀胶囊治疗肝纤维化的潜在靶点,见图3。

图3 克癀胶囊治疗肝纤维化潜在靶点图

表1 克癀胶囊潜在有效成分

2.4 克癀胶囊治疗肝纤维化的潜在KEGG通路 KEGG通路富集显著性排名前20的结果见图4,结果显示TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路被高度富集;除PI3K-Akt信号通路外,与肝纤维化有关的HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路也被富集。

图4 克癀胶囊治疗肝纤维化的KEGG通路富集图

2.5 克癀胶囊治疗肝纤维化的潜在生物功能 取显著性排名前5的条目作图,见图5。BP分析显示,克癀胶囊主要调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控和细胞因子介导的信号通路。CC分析显示,克癀胶囊主要调控细胞外间隙和细胞外区的反应。MF分析显示,克癀胶囊主要调控酶结合、转录因子活性和序列特异性DNA的结合过程。

图5 克癀胶囊治疗肝纤维化的GO分析富集图

2.6 克癀胶囊治疗肝纤维化的PPI网络和靶标网络 克癀胶囊治疗肝纤维化的PPI网络如图6所示。克癀胶囊治疗肝纤维化的核心作用靶点有JUN、STAT3、TP53、MAPK3、TNF、AKT1、MAPK1、MAPK14、IL6、CREB1等,见图7。其中JUN、STAT3、TP53为排名前3的Hub基因,在克癀胶囊治疗肝纤维化中起到重要作用。

图6 克癀胶囊治疗肝纤维化的PPI图

2.7 克癀胶囊治疗肝纤维化的物质基础 基于肝纤维化信号通路中的潜在靶标,对克癀胶囊中有效成分(中药单体)调控靶标进行计数,如图8所示,调控肝纤维化靶标超过5个的潜在有效成分如下:白花蛇舌草、甘草、黄柏、黄连、三七、皂角刺的槲皮素(quercetin),麝香的17β-雌二醇(17-beta-estradiol),皂角刺的漆黄素(fisetin),甘草、石菖蒲、皂角刺的山奈酚(kaempferol),甘草、郁金的柚皮素(naringenin),白花蛇舌草、黄柏、黄芩、三七、皂角刺的豆甾醇(Stigmasterol),防风、黄连、黄芩的汉黄芩素(wogonin),三七的人参皂苷Rh2(ginsenoside rh2),甘草的芒柄花黄素(formononetin),白花蛇舌草、大黄、防风、黄柏、黄芩、三七、郁金、皂角刺的β-谷甾醇(beta-sitosterol),大黄的芦荟大黄素(aloe-emodin),黄芩的黄芩素(baicalein)、刺槐素(acacetin)。以上这些有效成分可能是克癀胶囊治疗肝纤维化的物质基础。

图8 克癀胶囊有效成分调控肝纤维化靶点计数

3 讨论

中医学原本并无肝纤维化病名记载,依据肝纤维化的临床表现,中医学多将其归为“积聚”“胁痛”等。克癀胶囊主要适用于湿热毒邪内蕴、瘀血阻络型肝纤维化。湿热毒邪侵袭人体,日久瘀血内生,肝络受损,湿热毒瘀郁于肝脏,出现肝纤维化。克癀胶囊中黄芩、黄连、黄柏、白花蛇舌草、山银花、石菖蒲清热化湿,配以防风加强化湿作用;蛇胆、牛黄、冰片解毒,三七、郁金活血化瘀,麝香、皂角刺通络散瘀散结,甘草和中、调和诸药。

本研究RT-qPCR结果显示,克癀胶囊可降低小鼠肝组织的肝纤维化相关基因α-SMA、 COL1A1、TGF-β1 mRNA表达水平。HE染色和天狼星染色结果表明,克癀胶囊可改善CCl4诱导的小鼠肝细胞损害情况和胶原沉积等形态及病理学组织改变。α-SMA是肝星状细胞活化后的特异性蛋白,肝星状细胞激活后α-SMA会表达升高,可反应肝星状细胞激活后增殖的程度,是评估肝纤维化进展的重要指标[10]。COL1A1在肝纤维化进程中过度分泌的ECM蛋白组成之一,其过度积累形成纤维瘢痕[11]。TGF-β1是最有效的促纤维化细胞因子,可刺激肝星状细胞活化,增加ECM合成。

克癀胶囊药物组成中的白花蛇舌草、甘草、黄柏、黄连、三七、皂角刺均含有槲皮素,槲皮素靶点与肝纤维化疾病靶点交集较多。其有抗炎、抗纤维化等多种药理作用,能够体外抑制肝纤维化,对HSC有显著调控作用[12],对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠起保护作用[13]。甘草、郁金中的柚皮素,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和肝肾保护等多种作用,能抑制如肝脏等多种器官组织的纤维化[14]。皂角刺当中的漆黄素,是一种天然的黄酮类化合物,可抑制促炎反应,具有抗氧化和抗肿瘤作用[15,16]。漆黄素可能有助于改善高脂饮食诱导的肥胖及相关并发症,如高脂血症、肝纤维化等的有害影响。漆黄素通过增加对氧磷酶(PON)活性、脂肪因子失调、促炎细胞因子的产生和ECM在肝脏中的积聚减少过量活性氧化物(ROS)产生,从而有助于改善肝脏的脂毒性和纤维化[17]。甘草、石菖蒲、皂角刺中的山柰酚可有效地减轻肝纤维化形成,抑制 HSC活化,进一步抑制 HSC的体内和体外胶原合成。此外,三七总皂苷、黄芩苷、牛磺酸均有抗肝纤维化和抑制肝星状细胞作用[18-22]。

Hub基因网络提示JUN、STAT3、TP53基因被高度富集,说明克癀胶囊可能主要通过上述基因发挥抗肝纤维化作用。STAT3在介导肝损伤的过程中起关键作用,STAT3激活可在肝纤维化的发病机制中发挥抗炎或促炎作用,例如在HBV中的STAT3激活在大多数情况下作为促炎信号促进肝纤维化甚至肝癌[23]。TNF是一种调节细胞生长、分化、诱导炎症和调节凋亡的因子。当机体出现免疫应答和免疫损伤时,单核巨噬细胞能合成大量TNF-α,通过激活免疫级联反应触发炎症反应[24]。

KEGG结果中TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路等被富集,上述通路都与肝纤维化、细胞凋亡有关。表明克癀胶囊干预肝纤维化的活性成分作用的靶点可能分布于不同的信号通路,协同发挥作用。PI3K-Akt的激活在肝纤维化中发挥重要作用,PI3K-Akt信号通路是许多研究治疗慢性肝病的重要靶标。研究表明,通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路, HSC增殖和Ⅰ型胶原的表达和分泌可显著减少[25]。PI3K/AKT/mTOR信号通路还能调控HSC发生自噬,进而使HSC活化,导致肝纤维化的发生[26]。JAK2/STAT3信号通路是多种细胞因子共有的信号转导通路,参与细胞增殖、分化、凋亡等过程[19,27]。当信号通路被激活时,STAT3磷酸化并形成二聚体。转移到细胞核后,与特定的DNA序列结合,诱导相应基因的表达,激活和增殖HSC,最终导致肝纤维化。

克癀胶囊可改善CCl4诱导小鼠肝纤维化,可能是通过 TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路,调控JUN、STAT3、TP53等靶基因发挥抗纤维化作用。本研究为克癀胶囊治疗肝纤维化提供了科学的依据,为研究克癀胶囊治疗肝纤维化机制提供一定的方向。