张文思 陈晓蓉 杨宗国

上海市公共卫生临床中心 中医科 (上海, 201508)

肝细胞癌(HCC)目前被认为是一种发生于慢性肝病引起慢性肝脏炎症的免疫原性癌症[1-5]。在慢性肝脏炎症过程中,固有免疫细胞和适应性免疫细胞与肝组织细胞相互作用,被各种分子机制激活,促进肝损伤和HCC肿瘤免疫原性[6]。最近的研究证据表明,各种免疫细胞与肿瘤细胞有密切的相互作用。在肝癌形成过程中涉及肿瘤细胞生物学特性的许多分子机制也对免疫系统有相当大的影响[3]。

肿瘤浸润免疫细胞是复杂的肿瘤免疫微环境的一部分,与包括HCC在内的各种人类癌症的临床预后相关[2,7]。特定类型的免疫细胞不仅涉及宿主对肿瘤的防御[8],而且通过选择更适合在免疫活性宿主中存活的肿瘤细胞或通过在可促进肿瘤生长的肿瘤微环境中建立条件来加速促进肿瘤进展[9]。此外,肿瘤浸润免疫细胞在HCC预后中的预后作用仍存在争议,特异性免疫细胞对肿瘤进展具有双重作用[9-11]。CIBERSORT对基因表达数据的反卷积提供了有关HCC患者免疫细胞组成和预测值的宝贵信息[12-14]。本研究中,我们通过应用CIBERSORT方法研究肿瘤浸润免疫细胞的相对比例和分布,以及与HCC患者预后的相关性。

1 材料和方法

1.1 数据源 肝细胞癌患者基于HTSeq-FPKM平台的转录组基因表达数据来自癌症基因组图谱(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库的基因组数据共享数据门户。本研究下载了包括Cart、Manifest和Metadata在内的文件,共获得了374例肿瘤样本和50例非肿瘤样本。

1.2 CIBERSORT分析 通过估计RNA转录本的相对子集进行细胞类型识别的CIBERSORTfa是一种使用基因表达数据来估计组织样本的细胞类型组成的反卷积算法[12]。CIBERSORT基因特征矩阵,称为LM22,包含547个基因,可区分22种人类造血细胞表型,包括7种T细胞类型、初始和记忆B细胞、浆细胞、NK细胞和髓系亚群。来自TCGA-LIHC的所有样本都通过CIBERSORT分析了免疫细胞谱,其缺省特征矩阵为100个排列[12]。每个样本的22种免疫细胞类型以及CIBERSORT指标作为Pearson相关系数、CIBERSORTP值和均方根误差被量化。CIBERSORTP值反映了所有细胞子集的反卷积结果的统计显著性,可用于过滤掉拟合精度不太显著的反卷积。只有CIBERSORTP<0.05的数据被过滤并选择用于以后的分析。在TCGA-LIHC数据集的样本中,最终以CIBERSORTP≤0.05为标准纳入了2例非肿瘤样本和30例肿瘤样本。

1.3 生存分析 从cBioPortal for Cancer Genomics(https://www.cbioportal.org/)下载TCGA-LIHC的临床数据[15,16]。VLOOKUP函数用于匹配巨噬细胞M0和M1与TCGA-LIHC中的临床数据。研究纳入了包括总生存期(OS)和无病生存期(DFS)在内的HCC结局指标。

1.4 统计学方法 运用R语言中heatmap包(https://cran.rproject.org/web/packages/pheatmap/)对肿瘤和非肿瘤组织之间的免疫细胞进行热图分析,使用corrplot包(https://cran.rproject.org/web/packages/corrplot/index.html)进行免疫细胞的相关分析。Graphpad Prism v8.0(GraphPad Software,CA,US)用于统计分析,Student'st检验或Mann-WhineyU检验用于比较不同临床病理特征的巨噬细胞分布差异。双侧P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CIBERSORT免疫细胞组分的比较 以CIBERSORTP≤0.05为标准,从所有肝癌样本中纳入了2例非肿瘤样本和30例肿瘤样本,如图1所示。与非肿瘤组织相比,巨噬细胞M0在肿瘤组织中显著浸润。巨噬细胞M1在HCC患者的非肿瘤组织中显著高于肿瘤组织中的巨噬细胞。图2描述了HCC中肿瘤组织和非肿瘤组织之间22种免疫细胞的分布图。图3描述了肿瘤组织和非肿瘤组织中免疫细胞的分布热图。

图1 肿瘤组织与非肿瘤组织中免疫细胞分布差异

图2 肿瘤组织与非肿瘤组织22种免疫细胞分布图

图3 肿瘤组织和非肿瘤组织中免疫细胞的分布热图

2.2 免疫细胞的相关性 图4显示,基于CIBERSORT所选样本的免疫细胞之间Pearson相关性。在所有其他具有巨噬细胞M1的免疫细胞中,所有Pearson相关性都<0.5或>-0.5。

图4 基于CIBERSORT所选样本的免疫细胞之间Pearson相关性

2.3 HCC患者巨噬细胞M0和M1的生存分析 在TCGA-LIHC数据集中,361例病例在匹配临床数据和巨噬细胞CIBERSORT分数后被纳入分析。如图5A-B所示,与M0低浸润的患者相比,肿瘤组织中巨噬细胞M0高浸润的HCC患者其OS和DFS显著缩短(HR=2.06,95%CI=1.45～2.93,P<0.001和HR=1.58,95%CI=1.17～2.14P=0.004)。图5B-C示,HCC患者中巨噬细胞M1浸润程度与OS和DFS之间无统计学差异(P>0.05)。

图5 M0和M1浸润与HCC患者预后的关系

2.4 巨噬细胞M0与临床病理特征的相关性 如图6所示,在甲胎蛋白(AFP)升高的HCC患者中,巨噬细胞M0的CIBERSORT分数显著增加(P<0.05)。与AJCC Ⅰ期患者相比, AJCC Ⅱ-Ⅳ期HCC患者的CIBERSORT巨噬细胞M0分数显著更高(P<0.001)。巨噬细胞M0的CIBERSORT分数随着肿瘤病理组织学分级升高显著增加(P<0.05)。此外,巨噬细胞M0水平与HCC患者的血管浸润显著相关(P<0.01)。

图6 不同临床病理学特征的M0浸润程度比较

3 讨论

肿瘤中高密度的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)几乎是所有恶性肿瘤炎症浸润的主要成分[17,18]。在募集到肿瘤部位的固有免疫和适应性免疫细胞中,巨噬细胞特别丰富,并且存在于肿瘤进展的各个阶段。TAMs可分为M1和M2亚型,CD68是M1的生物标记,CD163和CD206是M2的生物标记[19,20]。

我们的结果显示巨噬细胞M0在HCC肿瘤中显著浸润,并与HCC患者的预后、晚期肿瘤分期和恶性表型相关。研究表明巨噬细胞对HCC生存预后无显著预测价值[21]。与其非肿瘤区域相比,已观察到HCC患者的肿瘤内区域巨噬细胞减少[22]。Li等[14]研究显示,巨噬细胞与HCC患者OS存在相关性,而对DFS无影响。Ding等[23]发现肿瘤样本中的巨噬细胞密度是OS和DFS的独立预测因子,而肿瘤周围巨噬细胞密度与HCC患者的OS和DFS均不相关。相反,也有报道称TAMs对HCC患者的OS和DFS具有保护作用[24]。一项荟萃分析表明,肿瘤内CD68+巨噬细胞与OS之间关联性无统计学意义,而肿瘤周围高密度CD68+巨噬细胞与HCC患者OS正相关[10]。CD163+巨噬细胞数量在瘤体较大、分化差的HCC患者中显著增加[25]。而且,高CD163+巨噬细胞水平显示预后不良,并与HCC患者的肿瘤结节和静脉浸润增加相关[20]。高度浸润的CD206+巨噬细胞与HCC患者侵袭性肿瘤表型和较差OS显著相关[21,26]。此外,TAMs可引发肿瘤内调节性T细胞增加,从而促进HCC进展[27]。巨噬细胞还具有免疫抑制作用,可在肿瘤进展过程中阻止自然杀伤细胞和T细胞对肿瘤细胞的攻击[18,28]。考虑到目前的证据,本研究认为TAM亚型的异质性及其起源和动态表型在HCC发生和进展过程中导致抗肿瘤或促肿瘤发生功能性差异[10,21,29-31]。

本研究表明,巨噬细胞M0促进了侵袭性肿瘤表型,包括HCC患者血管侵犯、晚期肿瘤分期和AFP升高。TAMs对肿瘤血管化的调控有较大影响[18,32]。病理分析发现,肿瘤组织中的巨噬细胞有助于分化良好的HCC患者肿瘤血管形成[33]。已有的证据表明TAM计数与HCC患者肿瘤微血管相关[34]。Ding等[23]发现邻近巨噬细胞浸润与血管侵犯相关,但与肿瘤内巨噬细胞浸润程度无关。巨噬细胞通过激活JAK2/STAT3/Snail通路以增强HCC细胞的迁移和侵袭能力,并诱导上皮间质转化[35]。CD68+巨噬细胞的数量在肿瘤Ⅳ期的HCC患者中显著增加[25]。基于既往研究证据和本研究结果,表明肿瘤浸润巨噬细胞加速了HCC的恶性肿瘤表型进展。