葛明然,张艳芳,邢丽南,赵令敏,张 勇,张晓蒙,刘小燕,霍秀文

(1.内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院/内蒙古自治区野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室,呼和浩特 010019;2.巴彦淖尔市农牧业科学研究院,内蒙古古巴彦淖尔 015000;3.鄂尔多斯市农牧业科学研究院,内蒙古鄂尔多斯 017000)

山药(DioscoreaoppositaThunb.)为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(DioscoreaL.),以块茎为主要产品器官的单子叶植物[1]。是药典佳品,滋补佳品[2],被誉为“中国小人参”。块茎的生长发育是受多种因素调节的复杂过程,其中激素作为主要影响因素之一,在该过程中发挥重要作用。有研究表明,赤霉素影响着块茎的形成[3-5]。

赤霉素(gibberellins,GAs)作为植物生长发育的主要激素之一,参与种子发芽[6]、茎的伸长[7]、果实的生长及品质形成[8]、植株生物量[9]、木质素的积累[10]、叶绿素的表达[11]等。赤霉素合成受内根-贝壳杉烯合成酶、GA-20氧化酶、GA-3氧化酶及 GA-2氧化酶等多个关键酶催化[12]。其中GA20ox是赤霉素生物合成中的关键酶,影响植物生长发育的复杂过程,内源赤霉素和外部环境因子对植物生长发育的调控均与GA20ox基因的表达水平有关[13],因此为探索该过程,分离和验证基因功能是非常重要的。目前,已在芍药[14]、葡萄[15]等植物中克隆获得了编码GA20ox的基因。

本研究以‘毕克齐’长山药(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和长芋’山药(D.oppositaThunb.;DHCY)为试验材料,克隆山药赤霉素合成酶基因DoGA20ox1(Unigene0027812,DoGA20ox1)的开放阅读框(ORF)及其与cDNA对应的gDNA,对其进行生物信息学分析及基因结构分析;构建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1瞬时表达载体,对该基因进行亚细胞定位;分析DoGA20ox1在2个品种山药块茎不同发育时期及不同器官的表达模式差异;构建pPZP221-DoGA20ox1植物表达载体,转化烟草。为初步解析GA20ox在山药块茎膨大过程中赤霉素合成的分子机理方面奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以内蒙古主栽品种‘毕克齐’山药(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和长芋’山药(D.oppositaThunb.;DHCY)为试验材料。于2020年5月初在内蒙古农业大学种质资源圃种植,取种植后90 d、105 d、120 d、135 d和150 d的山药块茎,3株混样,3次生物学重复。将取好的幼茎、叶和块茎立即液氮速冻,-80 ℃冰箱保存以备后续试验。

1.2 山药块茎总RNA的提取及cDNA合成

参照王金鑫等[16]试验方法,进行2个山药品种不同发育时期块茎、茎及叶的总RNA的提取(TaKaRa Mini Best Plant RNA Extraction Kit)及单链cDNA的反转录(TaKaRa ;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA SynthesisKit)。

1.3 DoGA20ox1的ORF的克隆

基于前期山药转录组测序数据(2018年由广州基迪奥生物科技公司测定),筛选赤霉素合成酶基因-GA20ox1(Unigene0027812)。通过Primer Premier 5.0设计GA20ox1的PCR扩增引物(表1)。反应体系及程序按照TaKaRa公司Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye说明书操作。取10 μL PCR产物进行电泳检测,并将产物送至生工生物工程股份有限公司测序。

表1 DoGA20ox1相关的引物序列Table 1 Related primer sequences of DoGA20ox1

1.4 生物信息学分析

运用下列软件对DoGA20ox1基因进行生物信息学分析(表2)。

表2 DoGA20ox1生物信息学分析相关软件Table 2 Related software of DoGA20ox1 bioinformatics analysis

1.5 DoGA20ox1 gDNA的克隆

利用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1),参照赵令敏[17]的试验方法克隆DoGA20ox1的gDNA序列( Takala;Premix LaTaqTM),将测序结果与cDNA序列进行比对,分析基因结构。

1.6 DoGA20ox1的亚细胞定位

设计含有BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位点的引物(表1),参照王金鑫等[16]的试验方法,构建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1载体。提取质粒,并通过冻融法转化农杆菌LBA 4404,制备侵染液,注射烟草叶片,使用激光共聚焦显微镜(Thermo Fisher Scientific)观察烟草叶表皮细胞中GFP的表达情况。

1.7 DoGA20ox1的表达分析

以山药的18S为内参基因,利用Primer Premier 5.0软件设计DoGA20ox1qRT-PCR引物(表1),参照王金鑫等[16]的试验方法(TaKaRa试剂盒;TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)进行qRT-PCR分析。

1.8 DoGA20ox1植物表达载体的构建及转基因烟草的获得

设计含有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点的DoGA20ox1-ZF/ZR引物,参照邵盈[18]的试验方法构建pPZP221-DoGA20ox1载体。提取质粒,并通过冻融法转化农杆菌EHA 101,制备菌液,侵染烟草叶片。经共培养、选择培养及生根培养后,采用PCR和RT-PCR方法分别检测转基因和野生型烟草叶片的DNA和RNA。

1.9 数据分析

用Excel 2007进行数据分析并制图,采用SPSS 25.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 DoGA20ox1基因的克隆

以山药块茎cDNA为模板,GA20ox1-ORF-F/R为引物进行PCR扩增,获得约1 400 bp的条带(图1),回收该克隆条带,连接转化后送测,经比对分析GA20ox1片段大小为1 359 bp,ORF长度为1 152 bp,共编码383个氨基酸(图2),将该基因命名为DoGA20ox1。

M. DL2000分子标记;1. DoGA20ox1 PCR产物M. DL2000 molecular marker; 1. DoGA20ox1 PCR product图1 DoGA20ox1的ORF扩增Fig.1 DoGA20ox1 open reading frame amplification

图2 山药块茎 DoGA20ox1的ORF序列及其推导的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence of yam tuber DoGA20ox1 and its deduced amino acid sequence

2.2 生物信息学分析

通过软件分析,得到DoGA20ox1基因编码蛋白的理论分子量为97.1 ku,分子式为C3490H5830N1152O1456S308,总原子数为12 236,理论等电点为5.01。对DoGA20ox1基因所编码氨基酸组成分析得出,预测DoGA20ox1编码的蛋白质为亲水蛋白,膜外蛋白。该蛋白主要由无规则卷曲(42.82%),α螺旋(34.73%)延伸链 (16.45%),β转角(6.01%)构成(图3)。11个物种GA20ox氨基酸序列比对发现,山药DoGA20ox1氨基酸序列与几内亚薯蓣(XM_039265410.1)、石斛(XM_020838041.2)、木豆(XM_020349629.2)、木豆(XM_020349471.2)、赤豆(XM_017558479.1)、绿豆(XM_014656961.2)、碧桃(XM_007219460.2)、扁桃(XM_034346565.1)、睡莲(XM_031637679.1)、绿豆(XM_014656962.2)序列相似性较高,分别为 93.81%、69.19%、 62.73%、62.72%、62.76%、61.93%、61.2%、 61.2%、59.26%、56.52%,且都具有20G-Fe (Ⅱ) oxygenase 保守结构域(图4)。构建 DoGA20ox1蛋白的系统进化树(图5),结果表明,山药与几内亚薯蓣之间的亲缘关系最为相近。

图3 DoGA20ox1蛋白的二级结构预测Fig.3 Secondary structure prediction of DoGA20ox1 protein

图5 DoGA20ox1及其同源序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of DoGA20ox1 and its homologous sequences

2.3 DoGA20ox1的蛋白相互作用网络

利用STRING在线网站,分别以马铃薯StGA20ox1为模板构建山药DoGA20ox1的相互作用网络。结果显示,GA20ox1与赤霉素合成的关键元件如GA2ox(GA2ox1、GA2ox5)、GA3ox(GA3ox1、GA3ox2)作用直接(图6)。

图6 DoGA20ox1的蛋白相互作用网络Fig.6 Protein interaction network of DoGA20ox1

2.4 DoGA20ox1基因的gDNA克隆

以山药块茎DNA为模板,GA20ox1-ORF-F/R为引物,经PCR扩增,得到长度为1 499 bp的gDNA序列,其包含4个外显子和3个内含子。4段外显子长度分别为567、245、77、263 bp,3段内含子长度分别为132、105、110 bp(图7)。

图7 山药 DoGA20ox1的cDNA和gDNA序列比对Fig.7 Comparison of cDNA and gDNA sequence of yam DoGA20ox1

2.5 DoGA20ox1的亚细胞定位

对重组质粒CaMV35S-GFP-DoGA20ox1进行PCR和双酶鉴定,PCR(图8-A)和双酶切(图8-B)均获得与阳性对照大小相同的条带,说明瞬时表达载体成功构建,可以进行下一步的亚细胞定位。

A.M1.DL5000 DNA标记;+.阳性对照;-.阴性对照;1.PCR;B.M2.DL15000 DNA标记;1.酶切鉴定;2.阳性对照;3.重组质粒A.M1.DL5000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1.PCR;B.M2.DL15 000 DNA marker; 1.Enzyme digestion identification;2.Positive control;3.Recombinant plasmid图8 PCR和双酶切法检测瞬时表达载体CaMV35S- DoGA20ox1Fig.8 Detection of transient expression vector CAMV35S- DoGA20ox1 by PCR and double digestion

注射烟草叶片,2 d后在激光共聚焦显微镜下观察。发现GFP的荧光信号均匀分布于烟草细胞内,DoGA20ox1-GFP荧光信号在质膜中定位较强(图9)。

图9 DoGA20ox1的亚细胞定位Fig.9 Subcellular localization of DoGA20ox1

2.6 DoGA20ox1基因的表达分析

qRT-PCR结果表明,在2个品种中,DoGA20ox1的表达存在差异。B1的DoGA20ox1基因的表达量呈“升-降-升”的变化趋势,在150 d时表达达到最高值;DHCY的DoGA20ox1基因的表达量与B1的变化趋势一致,120 d时达到峰值(图10-A)。DoGA20ox1基因的表达水平在山药块茎的膨大期,DHCY都显著高于B1。

A.山药块茎膨大期 DoGA20ox1的表达量变化;B. DoGA20ox1在不同组织中的特异性表达A.Changes in DoGA20ox1 expression during yam tuber expansion;B.Specific expression of DoGA20ox1 in different tissues图10 DoGA20ox1的表达分析Fig.10 Expression analysis of DoGA20ox1

DoGA20ox1基因在2品种山药不同组织中相对表达量也存在差异。B1中茎的表达量最高,而DHCY中叶片的表达量最高。DoGA20ox1基因在B1茎中的表达量分别为叶和块茎的2.31倍、29.76倍;在DHCY中,DoGA20ox1基因在叶中的表达量是茎和块茎的2.08倍、31.86倍。DHCY叶、块茎中的表达量明显高于B1,为4.29倍、6.9倍。因此,DoGA20ox1基因在山药中的表达具有特异性(图10-B)。

2.7 DoGA20ox1植物表达载体的构建

为了进一步阐明DoGA20ox1的功能,将该基因构建到pPZP221-35S-NOS载体中。PCR(图11-A)和双酶切(图11-B)检测,结果表明成功构建pPZP221-DoGA20ox1植物表达载体。

A.M1.DL2000 DNA标记;+.阳性对照;-.阴性对照;1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA标记;1.阳性对照;2.重组质粒;3.酶切鉴定A.M1.DL2000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA marker; 1.Positive control; 2.Recombinant plasmid; 3.Enzyme digestion identification图11 DoGA20ox1植物表达载体的构建Fig.11 Construction of DoGA20ox1 plant expression vector

2.8 转基因烟草的分子检测

选取10个转DoGA20ox1基因烟草植株,进行DNA提取及PCR检测。结果显示,10个转DoGA20ox1基因烟草植株中,8个株系的扩增条带均与阳性对照大小一致(图12)。表明DoGA20ox1基因成功转入到烟草的DNA中,且转化率为80.0%。

M.DL2000 DNA标记;+.阳性对照;-.阴性对照;CK.野生型烟草;1～10.转基因植株M.DL2000 DNA marker; +.Positive control; -.Negative control; CK.Wild-type tobacco; 1-10.Transgenic plant图12 转 DoGA20ox1基因烟草PCR检测Fig.12 PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

从PCR检测成功的8个转基因株系中随机提取5个植株(T-6、T-7、T-8、T-9和T-10)的RNA并进行RT-PCR检测。结果显示,5个植株的扩增条带均与阳性对照大小一致(图13),DoGA20ox1在转录水平成功表达。

M.DL2000 DNA标记;+.阳性对照;-.阴性对照;CK.野生型烟草;1～5.T-6、7、8、9、10转基因株系M.DL2000 DNA Marker; +.positive control ; -.negative control; CK.Wild type tobacco; 1-5.T-6,7,8,9,10 transgenic lines图13 转 DoGA20ox1基因烟草的RT-PCR检测Fig.13 RT-PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

3 讨 论

GA20ox是赤霉素生物合成的关键调控酶,它将非生物活性的GA53和GA12氧化为生物活性的GA20和GA9,进而调节赤霉素的含量。该酶属于20G-Fe (Ⅱ) oxygenase的双加氧酶,是一个2-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶超家族保守结构域,2-酮戊二酸和Fe2+能与底物相互作用发生反应进而催化赤霉素生物合成过程中不同的羟基化和去饱和步骤[19]。GA20ox也是目前研究最多的限速酶,先后克隆了30多种植物的GA20ox基因序列[20],其中包括马铃薯[21]、莴苣[22]等根茎类植物。GA20ox氨基酸序列与其他物种的同源性一般在50%～60%;并且植物GA20ox蛋白在进化方面较为保守,与同科植物的蛋白同源关系较近[13]。本研究克隆山药块茎的DoGA20ox1基因,该基因编码的氨基酸与几内亚薯蓣具有较高的相似度,为93.81%;同时,该氨基酸序列包含20G-Fe (Ⅱ) oxygenase保守结构域,这与GA20ox属于双加氧酶相吻合。

蛋白质是生物功能的直接体现,因此对其进行亚细胞定位也是必不可少的环节之一。Wang等[23]克隆了砀山酥梨PbGA20ox2基因,氨基酸序列比对发现了2OG-Fell_Oxy保守结构域,该基因位于细胞质、细胞核和质膜中。姜志昂等[24]克隆的苹果MdGA20ox1基因及闫蒙举等[25]克隆的葡萄VvGA20ox1、VvGA20ox2基因均定位于细胞核和细胞质膜。本研究山药DoGA20ox1基因亚细胞定位结果显示,该基因定位于质膜。GA20ox的定位模式多样,可能因品种而异,也可能由于发挥的功能不同。

每个基因转录产生的mRNA的量受到多种因素的调节,并且在植物发育的不同阶段或不同的组织水平上有所不同。GA20ox基因在不同植物中有特异性表达,主要表达在嫩叶、种子、新芽、茎和花中。芍药PlGA20ox基因在各器官中均有表达;其中芽的表达量最高,花瓣次之,根等表达量较低[14]。GA20ox1基因在草地早熟禾叶片中表达量最高,在根中表达量较低[25]。番荔枝AsGA20ox基因在种子、幼茎段表达量较高[26]。GA20ox基因表达还可能与内源赤霉素的生成量呈相关关系,从而促进块茎类植物结块[27]。敖兰吉亚等[5]研究结果表明B1的GA3含量由块茎膨大中期末至块茎膨大盛期呈明显下降趋势,而DHCY的块茎形成的时间,比B1早15 d左右。王金鑫等[16]测定B1和DHCY块茎的赤霉素含量显示,B1的赤霉素含量高于DHCY。本研究结果表明,DoGA20ox1的表达水平在B1和DHCY中存在差异,在山药块茎的膨大期,DHCY都显著高于B1。由此表明,低浓度的赤霉素含量可能会促进块茎形成,还有待进一步研究。本研究还构建了DoGA20ox1基因的过表达载体pPZP221-DoGA20ox1,可为后续探究DoGA20ox1基因在山药块茎发育中的功能奠定理论基础。