赵 莹,游普云,盛誉妍,高 璐,朱奎成,何美霞

1)郑州大学医药科学研究院 郑州 450052 2)郑州大学医学科学院 郑州 450052

顺铂是肿瘤化疗的主要药物之一,但肾毒性和骨髓抑制毒性影响了其在临床上的应用[1]。目前对于顺铂不良反应的处理手段十分有限,急需有效的药物。生物活性肽是一类来源于动植物并具有生物活性的肽类物质,其作用主要包括抗氧化、调节血压、降低胆固醇、抑菌、抗肿瘤和提高免疫力等[2]。本研究通过制作小鼠顺铂肾损伤模型,研究白蛋白肽、小麦低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽这4种生物活性肽对顺铂不良反应的影响,同时探讨其药理活性与抗氧化作用的关系,旨在为生物活性肽类的开发和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂与仪器C57BL/6雄性小鼠,SPF级,6～8周龄,体重160～170 g,许可证号:SCXK(豫)2017-0001,由河南省实验动物中心提供。顺铂(江苏豪森药业股份有限公司),尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒和总蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;ATP含量检测试剂盒和超微量Na+,K+-ATP检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。YQ-3 型电动漩涡匀浆机(江苏江阴周庄科研器械厂),IMark 酶标仪(北京友华照钦医疗器械有限公司),ULTRA-TURRAX高速分散机(德国IKA公司),Pentra 80全自动血细胞计数仪(日本HORIBA公司),透射电子显微镜(日本Hitachi公司),超声波粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 实验分组及给药将42只C57BL/6雄性小鼠采用随机数字表法均分为6组(n=7):正常对照组、顺铂模型组、白蛋白肽组、小麦低聚肽组、大豆肽组、玉米低聚肽组。4种生物活性肽组每天先以4 mg/kg剂量腹腔注射顺铂,30 min后以600 mg/kg剂量灌胃给予活性肽,隔天1次;顺铂模型组每天以4 mg/kg剂量腹腔注射顺铂,30 min后灌胃给予等体积的蒸馏水,隔天1次;正常对照组每天腹腔注射等体积的生理盐水。以上处理持续5 d,共注射3次。

1.3 外周血白细胞计数(WBC)和血小板计数(PLT)的检测在各组小鼠给药后第6天,眼内眦静脉取血约1 mL,加EDTA抗凝,用血细胞计数仪检测WBC、PLT。

1.4 血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的检测将1.3中所取静脉血离心取血清,按照试剂盒说明操作,检测BUN、Scr、GSH含量和CAT活性。

1.5 肾脏MDA含量和SOD活性的检测给药后第6天,将小鼠颈椎脱臼处死后分离左侧肾脏,称取0.1 g肾脏皮质组织块置于0.9 mL生理盐水中,用匀浆机制备组织匀浆,向组织匀浆中加入1.5 mL组织裂解液,2 min后4 ℃、2 000 r/min离心15 min,取上清液,按试剂盒说明操作,检测MDA含量和SOD活性。

1.6 肾脏线粒体中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的检测取1.5中离心后的沉淀物,按照试剂盒说明操作,检测ATP含量和Na+,K+-ATP活性。

1.7 肾组织病理学观察及肾损伤评分对小鼠肾脏冠状位前1/2组织进行脱水、透明、包埋、切片,行PAS染色。每个切片选择5个区域,在显微镜下观察肾小管和肾小球的形态结构。肾小管扩张、刷状缘脱落、肾细胞坏死、空泡化等为肾组织损伤表现。根据损伤面积进行肾损伤评分。0分:无损伤;1分:损伤面积<10%;2分:损伤面积10%～;3分:损伤面积25%～;4分:损伤面积50%～;5分:损伤面积>75%。

1.8 统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析。各组间所有指标的比较均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠外周血WBC和PLT的比较结果见表1。由表1可知,与正常对照组相比,顺铂模型组小鼠WBC、PLT降低;与顺铂模型组相比,4种生物活性肽组小鼠WBC、PLT增加。

表1 各组小鼠外周血WBC和PLT的比较(n=7)

2.2 各组小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比较结果见表2。由表2可知,与正常对照组相比,顺铂模型组小鼠血清中BUN、Scr含量升高,GSH含量和CAT活性降低;与顺铂模型组相比,4种生物活性肽组小鼠BUN、Scr含量降低,GSH含量和CAT活性升高。

表2 各组小鼠血清中BUN、Scr、GSH含量和CAT活性的比较(n=7)

2.3 各组小鼠肾脏中MDA含量和SOD活性的比较结果见表3。由表3可知,与正常对照组相比,顺铂模型组肾脏中MDA含量升高,SOD活性下降;与顺铂模型组相比,4种生物活性肽组MDA含量均下降,SOD活性均上升。

表3 各组小鼠肾脏中MDA含量和SOD活性的比较(n=7)

2.4 各组小鼠肾脏线粒体中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比较与正常对照组相比,顺铂模型组小鼠线粒体/ATP含量和Na+,K+-ATP活性均降低;与顺铂模型组相比,4种生物活性肽组线粒体中ATP含量和Na+,K+-ATP活性均升高(表4)。

表4 各组小鼠肾脏线粒体中ATP含量和Na+,K+-ATP活性的比较(n=7)

2.5 各组小鼠肾组织病理学表现和肾损伤评分的比较结果见图1和表5。正常对照组小鼠肾小管形态完整,排列整齐。顺铂模型组小鼠肾小管上皮细胞出现水肿、坏死,并向管腔内脱落,管腔狭窄。4种生物活性肽组小鼠肾小管上皮细胞水肿现象均明显减轻,结构也较为完整。与正常对照组比较,顺铂模型组肾损伤评分升高;与顺铂模型组相比,4种生物活性肽组肾损伤评分均降低。

A:正常对照组;B:顺铂模型组;C:白蛋白肽组;D:小麦低聚肽组;E:大豆肽组;F:玉米低聚肽组

表5 各组小鼠肾损伤评分的比较(n=7)

3 讨论

顺铂是临床上应用广泛且疗效可靠的广谱抗肿瘤药物,具有明显的肾毒性和骨髓抑制毒性[3]。顺铂的肾毒性主要表现为肾小管上皮细胞急性坏死、变性及肾间质水肿等,大剂量或连续用药可导致肾功能衰竭甚至死亡[4];顺铂的骨髓抑制毒性主要表现为WBC和PLT减少[5]。本实验中在小鼠腹腔注射顺铂后,肾毒性和骨髓抑制毒性指标明显改变,表明小鼠顺铂肾毒性和骨髓抑制毒性模型复制成功。此外,研究[6]发现氧化应激与顺铂的毒性有关。血清中GSH含量和CAT活性、肾组织中MDA含量和SOD活性可以反映抗氧化能力的变化。在本实验中,顺铂可以导致小鼠血清中GSH含量、CAT活性和肾组织中SOD活性降低,肾组织中MDA含量升高,进一步说明了顺铂所致肾损伤可能与氧化应激反应有关。

目前临床上针对顺铂的骨髓抑制毒性,大多采用提升WBC和PLT等药物,但这类药物不仅价格高,而且本身就有较多的不良反应,如肌肉骨骼系统毒性和消化系统毒性,甚至还可能造成休克和间质性肺炎等[7]。白蛋白肽、小麦低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽这4种生物活性肽具有抗氧化、抗炎及免疫调节等生物活性[8],可通过清除ROS、降低MDA含量和增强抗氧化酶的活性[9-10]等途径,减轻氧化应激损伤。此外,它们还有安全性高、易于吸收、来源广泛以及价格低廉等优点[11]。在本研究中,给予这4种生物活性肽后,模型小鼠外周血WBC、PLT提升,血清中BUN、Scr含量降低,血清中GSH含量、CAT活性以及肾组织中SOD活性和肾线粒体中ATP含量、Na+,K+-ATP活性升高,肾组织中MDA含量下降,表明这4种生物活性肽均对顺铂导致的骨髓抑制有明显的缓解作用,而且可以提高小鼠的肾功能,改善肾小管损伤和肾脏线粒体损伤。

结合实验结果可以推测,这4种生物活性肽缓解顺铂所致肾损伤和骨髓抑制毒性可能与以下机制有关。①自由基清除作用:肽链上的组氨酸残基可作为氢的受体直接清除自由基,还能与Fe3+螯合减少活性氧自由基的生成[12];芳香族氨基酸如酪氨酸和苯丙氨酸往往通过向缺电子自由基提供质子来清除单线态氧,主要是氧自由基和超氧阴离子自由基[13];此外,还可能通过氧化应激通路促进组织中SOD活性的提高,加速ROS的清除,有效降低体内的氧化水平[14]。②抗脂质过氧化作用:肽末端含有疏水性氨基酸,能提供疏水环境,增强肽与不饱和脂肪酸的作用,从而有效促进膜脂过氧化[8]。自由基被清除也可减弱生物膜的过氧化反应[15],进而减轻顺铂所致的肾损伤。③改善线粒体功能:氧化应激产生过多的氧自由基,可引发碱基配对错误和链断裂等线粒体损伤,以及线粒体膜脂质过氧化导致的线粒体功能障碍[11]。4种生物活性肽可使小鼠肾脏线粒体中ATP含量和Na+,K+-ATP活性升高,维持其正常的膜通透性和膜电位。④增强机体免疫功能:4种生物活性肽缓解骨髓抑制毒性的作用机制可能与增加T淋巴细胞数量有关[5,8],还需要进一步深入的研究。

总之,本研究证实了白蛋白肽、小麦低聚肽、大豆肽和玉米低聚肽这4种生物活性肽均能明显减轻顺铂所致的小鼠肾毒性和骨髓抑制毒性;同时,这4种生物活性肽可改善肾脏线粒体损伤,降低肾组织氧化应激水平。