王奇林,董昌武,徐 慧,刘 阳,李 茜,宋 敏

(安徽中医药大学,安徽 合肥 230012)

自发性高血压是一种由多种因素引起的血压升高的全身性疾病,是心脑血管疾病最主要的诱发因素,可对多个重要脏器造成损害,如心、脑、肾,并可最终导致这些脏器衰竭[1-2]。高血压病引起的心肌病变是导致心脏受损的主要因素,中国每年约有200万患有高血压病的个体发生心功能损伤[3],其中自发性高血压约占40%。目前,自发性高血压的治疗方式主要使用一线降压药控制血压,如临床常用钙离子拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等,用药时间几乎贯穿整个发病过程,长时间的高血压状态所产生的并发症对机体造成的伤害远大于高血压本身。

中药治疗自发性高血压有降压后不易反弹的优势。因此,寻找行之有效的中药治法或中西药结合治法将有助于降低高血压及其并发症对人体的损害。自发性高血压损伤心脏的主要方式是心室重构,心室重构最主要的病理变化是心肌纤维化[4],故预防心肌纤维化是防治自发性高血压并发症的一个重要方向。研究[5-7]显示,心肌纤维细胞的增殖、转分化在心肌纤维化中具有重要作用,在转分化的心肌成纤维细胞内可进一步激活结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)[7]、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等心肌纤维化的相关因子,从而导致心肌纤维化的发生发展。

滋阴潜阳方[8]是临床治疗自发性高血压的有效方,其主要由龟板、石决明、煅牡蛎、制何首乌、钩藤、熟地黄、生地黄、川芎等组成。前期研究[9]发现,滋阴潜阳方具有改善“两肾一夹”高血压大鼠左心室重构的作用,但其对心肌纤维化的影响机制尚未明确。本研究建立自发性高血压大鼠模型,观察滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠左心室重构的改善作用并探究其抑制心肌纤维化的机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性自发性高血压大鼠40只,12周龄,体质量为(230±20)g,SPF级Wistar雄性大鼠10只,体质量为(230±20)g。所有动物均购自维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011。所有大鼠均饲养于安徽省医学科学研究院动物实验中心,室温为(23±3)℃,湿度控制为(45±5)%,12 h光暗循环。本研究由安徽中医药大学伦理委员会批准,证明号:2022021。

1.2 药物 滋阴潜阳方药物组成:龟板、石决明(先煎)、煅牡蛎(先煎)各30 g,制何首乌、钩藤(后下)各20 g,熟地黄、生地黄、川芎各15 g,以上药物均购自安徽中医药大学第一附属医院中药房。煎煮方法:连续2次煎药,取2次过滤液,再置于低温恒温水浴中浓缩至含生药质量浓度为2 g/mL,药液装瓶,4 ℃存储。依那普利(江苏制药股份有限公司生产,国药准字号H32026567,每片10 mg),购自安徽中医药大学第一附属医院西药房。

1.3 仪器 大鼠无创血压测量系统(NS60):上海玉研科学仪器有限公司;电泳仪(型号 EPS300)、电泳槽(型号 VE-180)、转膜仪(型号 VE-186):上海天能科技有限公司;高速冷冻离心机(型号 JW-3021HR):安徽嘉文仪器装备有限公司;荧光定量PCR仪(型号 PIKOREAL 96):Thermo Scientific。

1.4 试剂 α-SMA抗体(批号 AF10212367P)、Col-Ⅰ抗体(批号 AI04234760)、CTGF抗体(批号 AD19286640):Bioss;GAPDH(批号210040421):Zsbio;PVDF膜(批号R7SA9081E):Millipore;反转录试剂盒(批号AL50947A):TaKaRa。

2 方法

2.1 动物分组及给药 根据《实验动物学》[10],以大鼠收缩压高于115 mmHg判定为高血压模型复制成功;以性情易激惹、饮水量增加判定大鼠证型为阴虚阳亢;综合以上标准,判断自发性高血压大鼠是否符合阴虚阳亢型高血压模型。

将40只符合模型标准的自发性高血压大鼠随机分为模型组,滋阴潜阳方高、低剂量组,依那普利组,每组10只,另取10只Wistar大鼠作为正常组。模型组和正常组大鼠每日给予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃。根据《实验动物学》[10]中常用实验动物与人的体表面积比例换算方法,依那普利组给予依那普利1.05 mg/(kg·d),滋阴潜阳方低、高剂量组分别给予大鼠5.85、23.4 g/(kg·d)(分别相当于成人临床用药的等效剂量1、4倍剂量)滋阴潜阳方汤剂灌胃,每日2次,连续给药6周。

2.2 血压测量 用无创血压采集系统分别测量各组大鼠尾动脉收缩压4次,依次为给药前,给药2、4、6周后。每次每只大鼠测量3次,取平均值。

2.3 取材 药物干预6周后,用20%乌拉坦对大鼠进行腹腔注射麻醉。迅速处死大鼠,开胸,取出心脏。一部分心肌组织用预冷的生理盐水冲洗残留血液后固定于4%多聚甲醛溶液中,24 h后进行组织脱水、包埋及切片处理。另一部分心肌组织用PBS洗涤血液后,用组织剪剪成小拇指指甲盖大小的小块,液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中备用。

2.4 Masson染色观察大鼠心肌纤维化情况 心肌组织切片后脱蜡至水,进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色。显微镜下观察各组切片染色情况,胶原纤维呈蓝色,肌纤维呈红色,随机选取5个视野留取图像进行分析。

2.5 Western blot法检测大鼠心肌组织CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表达水平 每组各取3只大鼠左心室组织样本100 mg,加入RIPA细胞裂解液600 μL(内含0.6 mmol PMSF)进行裂解。12 000 r/min离心15 min,收集上清液,即为总蛋白液。在SDS-PAGE胶中电泳,电泳结束后转印到PVDF膜,转印结束后将PVDF膜放入 Western封闭液(5%脱脂奶粉)中封闭2 h。按照合适的比例用一抗稀释液进行稀释,4 ℃缓慢摇动孵育过夜。加入PBST,每次洗涤10 min,共洗涤3次。洗膜结束后用二抗室温孵育1.2 h,洗涤液将条带放入ECL显影液,用凝胶图像处理系统分析条带,以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

2.6 RT-PCR法检测大鼠心肌组织CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA表达水平 每组各取3只大鼠左心室组织100 mg,加入1 mL TRIzol裂解。待裂解完全后室温放置5 min。12 000 r/min离心10 min,取上清液,加入适量无水乙醇。混匀后加入到RNA提取柱中,依次加入反应液,提取总RNA溶液,测定总RNA浓度及纯度后逆转录,即为cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR检测,以正常组为参照组,β-actin为内参,以2-ΔΔCT法计算各组大鼠心肌组织CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA的表达量。引物合成序列见表1。

表1 β-actin、α-SMA、Col-Ⅰ、CTGF引物合成序列

3 结果

3.1 各组大鼠收缩压比较 与正常组比较,各时点各组大鼠尾部收缩压显著升高(P<0.05),表明模型复制成功;模型组大鼠收缩压随时间而逐渐升高。与模型组比较,给药2周后依那普利组与滋阴潜阳方高剂量组大鼠收缩压均显著降低(P<0.05),其中滋阴潜阳方高剂量组收缩压降低更明显(P<0.05);与模型组比较,给药4、6周后依那普利组,滋阴潜阳方高、低剂量组大鼠收缩压均显著降低(P<0.05),其中以滋阴潜阳方高剂量组降低作用最明显,依那普利组次之(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠收缩压比较

3.2 各组大鼠心肌组织纤维化情况比较 模型组大鼠心肌组织可见大量蓝色心肌胶原纤维增生,心肌纤维化明显;与模型组相比,滋阴潜阳方高剂量组与依那普利组大鼠心肌组织蓝色心肌胶原纤维明显减少,而滋阴潜阳方低剂量组大鼠心肌组织仍可见大量蓝色心肌胶原纤维增生。见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.滋阴潜阳方高剂量组;D.滋阴潜阳方低剂量组;E.依那普利组图1 各组大鼠心肌组织纤维化情况比较(Masson染色,10×20倍)

3.3 各组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表达水平比较 与正常组比较,模型组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。见表3、表4、图2。

注:A.正常组;B.模型组;C.滋阴潜阳方高剂量组;D.滋阴潜阳方低剂量组;E.依那普利组图2 各组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表达水平比较

表4 各组大鼠心肌组织Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA mRNA表达水平比较

4 讨论

研究[12-14]表明,中医药在治疗高血压病及其并发症方面确有良好疗效。自发性高血压属中医学“眩晕”“头痛”等范畴,由多种内外因素相互影响而成,中医认为,本病的病机以阴虚为主,尤以心、肝、肾三脏阴虚所致。肝肾阴虚致阳亢难制,肾水不足亦导致心阴不足、心肾不交,长期心阴不足造成心气亏虚甚或心阳不振,导致水湿甚或瘀血的产生,水湿、瘀血内阻则导致疾病发展及加重。本病病位在心,常累及肝、肾、脾、肺等脏器,临床治疗多采用滋阴、潜阳、祛湿、活血等方法。高尔鑫教授根据本病的病因病机,创制具有滋阴潜阳作用的中药复方滋阴潜阳方,该方是在镇肝息风汤和天麻钩藤饮的基础上化裁而来,临床用于治疗自发性高血压疗效良好[15-16]。滋阴潜阳方通过益阴补血、祛瘀通络改善自发性高血压造成的心脏损伤。方中重用龟板、生地黄、熟地黄滋养肝肾之阴,加入钩藤降压作用良好;石决明、牡蛎两药重镇潜阳,川芎活血祛瘀通络,针对本病本虚标实之病机。诸药共奏滋阴潜阳之功,从而有效治疗阴虚阳亢型高血压。自发性高血压所致心肌纤维化的临床症状可表现为心胸憋闷、疼痛,并伴有头晕或头痛。憋闷、疼痛多为血行不畅所致,阴血同源,长期心肾不交导致心血不足,滋阴潜阳方中用牡蛎、龟板两药补心血之亏兼养心神,再加生地黄、熟地黄两药以滋肾阴,共奏滋养心肾之功;头晕、头痛多为阳亢难制所致,方中钩藤制风、川芎活血祛瘀通络。诸药共用,标本兼治,故药味虽少,疗效颇佳。滋阴潜阳方可有效改善自发性高血压所致心肌纤维化。

心肌纤维化主要表现为胶原沉积、比例失调并伴有心肌成纤维细胞的增生[17]。血管紧张素Ⅱ、醛固酮等促成高血压的因子可促进心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,导致胶原蛋白被大量合成,从而导致和加重心肌纤维化[18]。α-SMA是肌成纤维细胞活化的标志性蛋白,肌成纤维细胞可大量合成Col-Ⅰ,导致胶原代谢异常[19]。CTGF作为促成纤维细胞分裂和胶原沉积的细胞因子,可介导血管紧张素Ⅱ、转化生长因子-β的部分生物效应,从而刺激心肌成纤维细胞增殖和细胞外胶原的沉积,在促进纤维化方面发挥重要作用[20]。

本研究结果显示,滋阴潜阳方具有降低自发性高血压大鼠收缩压的功效,随着给药时间的延长,大鼠的收缩压呈持续降低状况,与前期实验结果一致[8]。滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组可明显降低自发性高血压大鼠的收缩压(P<0.05),而低剂量组降压作用不明显。滋阴潜阳方高剂量组和依那普利组可明显降低自发性高血压大鼠心肌组织中Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表达水平(P<0.05),而低剂量组作用不明显。

综上,滋阴潜阳方可能通过抑制心肌成纤维细胞的增殖和转分化等过程,抑制自发性高血压大鼠心肌纤维化的发展,其作用途径有待进一步研究。