◎ 薛壹帆，杨 磊，胡家玮，陈 贝，周 威,2

（1.武汉轻工大学 医学与健康学院，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学康养产业研究院，湖北 武汉 430023）

糖尿病是目前世界高发病之一，是一种常见的代谢性疾病，是由遗传基因、免疫功能紊乱等多种病因引起的，以高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征[1]。随着人们生活水平的提高和生活方式的变化，糖尿病的患病率不断提升，人们对天然药食同源性食物辅助治疗及控制糖尿病及其并发症的需求不断增多。

三白花茶（代用茶）是干鱼腥草提取物与绿茶粉末的混合物，属于武汉康达尔生物科技有限公司代用茶产品；其中鱼腥草为三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，属于《中国药典》收录的中药材，并属于国家卫健委规定的药食同源类中药来源。已有资料显示，鱼腥草、绿茶均有辅助降低血糖、抗炎、降低糖尿病多种并发症发病率及程度的作用[2-5]。在现有三白花代用茶的制备工艺中，是采用干品鱼腥草提取物与绿茶进行混合制粒。本次研究依照三白花产品的配方，采用与配方表中剂量一致的干、鲜鱼腥草提取物与绿茶混合制成两种制剂，以空腹血糖值、血清胰岛素值、α-葡萄糖苷酶体外抑制率、α-淀粉酶体外抑制率为指标，研究两种制剂对糖尿病模型小鼠的作用及可能机制，并比较两种制剂的相应效应。

1 材料与方法

1.1 仪器、药品与试剂

DFT-200 手提式中药粉碎机，江阴市洲元药化机械制造有限公司；Aquaprince AJC-0501-P 纯水机；美国Bio Tech EPOCH 全波长酶标仪；Eppendorf Centrifuge 5702 高速冷冻离心机；TGL-16C 高速离心机，上海安亭科学仪器厂；金叶SHZ-Ⅲ型真空泵，上海亚荣生化仪器厂；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KH3200DB 超声波振荡器，江苏昆山禾创超声仪器有限公司；JY6001 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；安稳免条码型三诺血糖仪及血糖试纸，湖南三诺。

三白花茶（含干鱼腥草提取物）、鲜鱼腥草提取物与绿茶混合中试样品均由武汉康达尔生物科技有限公司检测合格并提供，其中三白花茶批号为 161122；α-淀粉酶（河南圣斯德，20180127）、α-葡萄糖苷酶（G5003100UN）及四氧嘧啶（纯度≥98%，2244-11-3）均为Sigma 公司产品；CUSABIO 小鼠α-葡萄糖苷酶ELISA 试剂盒（货号：CSB-E09907m，批号：Y13010138）、CUSABIO 小鼠胰岛素试剂盒（货号：CSB-E05071m，批号：X03010136）、淀粉酶试剂盒（货号：C016，批号20181010），南京建成；其余化学试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

实验用SPF 级雄性昆明小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，鼠龄5 ～6 周，动物许可证号为SCXK(鄂)2004—0007，体重为（25±5）g。

1.3 方法

1.3.1 动物灌胃剂量、模型建立与分组

根据三白花代用茶推荐剂量及使用方案，取6 g·d-1的人用剂量；依据文献[6]中动物与人体表面积比换算法，将其换算成小鼠用原颗粒量为0.78 mg·g-1·d-1。将含干鱼腥草的三白花茶（以下论述为干鱼腥草组）、鲜鱼腥草的代用茶（以下论述为鲜鱼腥草组）颗粒，以10 倍量新制沸水超声提取30 min，离心取清液。取同批次雄性小鼠，依据体重编号并随机分成正常组、模型组，按照文献[4]的方法使用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型。模型组造模前16 h 禁食不禁水，按200 mg·kg-1（小鼠体重）腹腔注射四氧嘧啶（2.5%生理盐水溶液），正常组腹腔注射同剂量生理盐水。造模小鼠72 h 后尾部取血，测定空腹血葡萄糖水平；将血糖值在11.0 mmol·L-1以上的小鼠定为糖尿病模型鼠，并依据体重编号并随机分成模型组、干鱼腥草组、鲜鱼腥草组。模型小鼠数目不足时采用上述造模方法从正常组备用鼠中随机选择、造模并测试达标后随机进入模型组、干鱼腥草组、鲜鱼腥草组中。

1.3.2 动物给药

根据1.3.1 分组及折算后的给药量，根据小鼠体重计算实际灌胃给药量。正常组及模型组按0.1 mL/10 g（小鼠体重）给予生理盐水；干、鲜鱼腥草组药液按0.1 g·mL-1的提取物浓度进行配制，并依据小鼠体重按上述给药方案确定实际小鼠灌胃剂量。各组小鼠依规范灌胃并饲养14 d。

1.3.3 小鼠血清样本采集及指标测定

于动物实验第14 天灌胃完毕后，小鼠禁食不禁水12 h。摘除小鼠眼球方式取血，采用血糖试条测定空腹血糖值。血液滴入离心管中，置于冷冻离心机中，4 ℃下3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，严格按试剂盒说明书进行操作，检测血清中胰岛素的浓度。

1.3.4 干、鲜鱼腥草组对α-淀粉酶的体外抑制实验

根据文献[7-8]的方法，采用碘比色法测定干、鲜鱼腥草制备的三白花茶颗粒体外对α-淀粉酶活力的抑制率。将两组颗粒粉碎过80 目筛，使用pH 值为6.8 的缓冲液配制成混悬液并超声混匀。根据文献[8]及预实验结果，准确称取淀粉酶、小麦淀粉并用pH值为6.8 的缓冲液溶解至终浓度分别为0.03 mg·mL-1、25 mg·mL-1，并与不同浓度的干、鲜鱼腥草组（终浓度为0.1 ～10.0 mg·mL-1）混合并制成不同浓度的干、鱼腥草组样品液。同时制备不加干、鲜鱼腥草混悬液的对照液（仅含小麦淀粉及淀粉酶），以及不含α-淀粉酶及淀粉仅含不同浓度样品的去α-淀粉酶空白溶液。将上述溶液加入比色管中，摇匀，37 ℃水浴反应15 min。反应完毕后离心取上清液，严格按照淀粉酶试剂盒操作，并于660 nm 测试OD值，并通过公式（1）计算对α-淀粉酶的抑制率。每个样品浓度制成3 个样本反应并测试，取3 次测试结果的平均值。

式中：A样品为不同浓度干、鲜鱼腥草组样品溶液吸光度值；A对照为未加样品的吸光度值；A空白为未加淀粉酶、淀粉的不同浓度样品溶液吸光度值。

1.3.5 干、鲜鱼腥草组对α-葡萄糖酶的体外抑制实验

根据文献[9]的方法，采用ELISA 法测定干、鲜鱼腥草制备的三白花茶颗粒体外对α-葡萄糖酶的抑制率。与1.3.4 处理方法一致，将两组颗粒粉碎过80 目筛，使用pH 值为6.8 的缓冲液配制成不同浓度的混悬液；对照品为未加鱼腥草的蔗糖样品。二者与一定量α-葡萄糖苷酶混合；另一部分不与葡萄糖苷酶混合。严格按照α-葡萄糖酶试剂盒方法进行操作，测试反应后葡萄糖苷酶活力，并通过公式（2）计算对α-葡萄糖酶的抑制率。

式中：A空白为未加鱼腥草样本溶液吸光度值；A样品为含鱼腥草样品溶液吸光度值；A背景为未加葡萄糖苷酶样品溶液吸光度值。

1.3.6 统计学处理

实验数据均以±s表示，并进行独立样本t检验，通过SPSS 17.0 完成统计分析；以P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 动物观察

造模前，各组小鼠活动状况无明显差异。随着造模时间推移，模型组小鼠体重有增加趋势，且发现垫料中尿液等分泌物增多，笼内气味较重。动物实验开始前及至取样本前动物平均体重见表1。结果显示，模型组在饲养前后体重有显著差异，且有统计学意义（P＜0.05）。其他组有体重升高趋势，但没有统计学意义。

表1 各组动物平均体重表（±s，n=6）

表1 各组动物平均体重表（±s，n=6）

注：“*”表示饲养前后体重有显著性差异，P ＜0.05。

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2.2 不同组小鼠饲养前、后血糖测试结果

依照1.3.3 方法，各组造模后空腹血糖测试结果及饲养14 d 后小鼠空腹血糖测结果见表2。结果显示，模型组、干鱼腥草组、鲜鱼腥草组造模后空腹血糖值均高于11.0 mmol·L-1，各组间无显著性差异；而与正常组有显著性差异，且有统计学意义（P＜0.05）。饲养14 d 后，干、鲜鱼腥草组平均血糖值与模型组相比有明显下降，且有统计学意义（P＜0.05），但3 组与正常组比较，平均血糖值依然偏高，且有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组动物平均血糖值表（±s，n=6）

表2 各组动物平均血糖值表（±s，n=6）

注：“*”表示与同实验段正常组有显著性差异；“◆”表示与同实验段模型组有显著性差异，P ＜0.05。

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2.3 不同组小鼠饲养后血清胰岛素浓度

依照1.3.3 方法，各组14 d 饲养后血清胰岛素浓度测试结果见表3。结果显示，模型组小鼠血清胰岛素浓度明显低于正常组，且有统计学差异（P＜0.05）；干、鲜鱼腥草组血清胰岛素浓度明显高于模型组，且有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组动物血清胰岛素浓度表（±s，n=6）

表3 各组动物血清胰岛素浓度表（±s，n=6）

注：“*”表示与模型组胰岛素浓度有显著性差异，P＜0.05。

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2.4 鲜、干鱼腥草组对α-淀粉酶的体外作用

依据1.3.4 方法，不同浓度鲜、干鱼腥草对α-淀粉酶体外作用结果见表4。从表4 结果可以看出，从1.0 mg·mL-1剂量开始，鲜、干鱼腥草组对α-淀粉酶有一定抑制作用，但浓度高于5.0 mg·mL-1以后其抑制率增长缓慢，没有随剂量明显升高的趋势。考虑到代用茶口感的要求，鱼腥草浓度不能过高；由体外实验结果并结合文献[8-9]可知，无论是鲜鱼腥草还是干鱼腥草，其制备的三白花茶均对α-淀粉酶无较强的抑制作用。

表4 不同浓度鲜、干鱼腥草组对α-淀粉酶的体外抑制率表（-x±s，n=3）

2.5 鲜、干鱼腥草组对α-葡萄糖酶的体外作用

依据1.3.5 方法，不同浓度鲜、干鱼腥草对α-淀粉酶体外作用结果见表5。从表5 结果可知，鲜、干鱼腥草组对α-葡萄糖酶均有较强的抑制作用，在1.2 mg·mL-1时抑制率都能达到或接近50%。且从结果分析可知，从1.5 mg·mL-1开始，鲜鱼腥草组抑制率明显高于同浓度干鱼腥草组，且有统计学差异（P＜0.05）。

表5 不同浓度鲜、干鱼腥草组对α-葡萄糖酶的体外抑制率表（-x±s，n=3）

3 结论

资料显示，鱼腥草及绿茶提取物均对糖尿病及其并发症有辅助治疗及缓解作用[2-5]。本次实验围绕已形成产品的“干鱼腥草提取物+绿茶”代用茶颗粒及含鲜鱼腥草提取物中试技术改造产品展开研究，在人常用量的基础上，进行小鼠整体动物实验及体外对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用实验，确认其可能的辅助治疗糖尿病的效应及机制。实验结果显示，常用剂量在小鼠灌胃实验中，能明显控制糖尿病模型鼠的体重增加趋势，降低其异常升高的空腹血糖值，且使模型鼠血液中胰岛素含量升高，从而达到控制糖尿病特征指标的效应。相关制剂体外实验结果显示，常用剂量下含鲜、干鱼腥草的相关制剂对α-淀粉酶的抑制效果不明显；对α-葡萄糖苷酶抑制效果明显，且含鲜鱼腥草提取物的制剂在1.5 mg·mL-1以上浓度时，抑制效果明显强于含干鱼腥草提取物的制剂。这为“三白花”代用茶今后的技术改造及产品升级奠定了一定基础。

糖尿病已属于与营养代谢有关的慢性非传染性疾病，随着现代社会的发展及人们生活方式的转变，其发病率呈逐年上升趋势。在糖尿病治疗与症状控制的过程中，一定剂量的药食同源类产品（如代用茶）可作为糖尿病人较为安全的临床治疗辅助手段。天然茶饮、药食同源等辅助治疗模式，是针对慢性非传染性疾病的自然疗法的重要方向。糖尿病作为慢性代谢性疾病，在特征性药物控制的前提下，辅助以有剂量依据的能控制糖尿病指标的“三白花”茶等食疗、茶疗方案，为慢性非传染性疾病的治疗及症状控制提供了良好的研究思路及应用前景。