王 宇，国 霞，王 伟

（淄博市淄川区疾病预防控制中心，山东淄博 255100）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性致病菌且在自然界中广泛存在[1]。研究表明，每年的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件约占25%，已经成为我国引发细菌性食物中毒的主要致病因子之一[2]。蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种条件致病杆菌，易污染该菌的食物有米制品、乳类、熟肉、蔬菜及汤类等。被污染的食品外观一般无异常且无异味，容易被忽略，该菌可产生肠毒素，通常食用含菌量大于105CFU·mL-1（CFU·g-1）的食品即可引起人呕吐型或腹泻型食物中毒[3]。

1 材料与方法

1.1 样本来源

患者呕吐物2 份（编号1#、2#）；面包包装袋样本2 份、面包屑1 份、吃剩鸡腿样本1 份、鸡腿包装袋2 份、柠檬水1 份和可乐鸡米饭1 份，依次编号为3#～10#，以上采集样品均放置在无菌采样袋中。

1.2 仪器与试剂

GSP-9050 隔水式培养箱、JSH-250 生化培养箱、生物显微镜、生物安全柜、Baird-Parker（B-P）琼脂平板、沙门菌属显色培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP），均由青岛海博生物科技公司提供；营养琼脂均由北京陆桥公司提供；GP 生化鉴定卡；磷酸盐缓冲液（PBS）；A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素实时荧光PCR 检测试剂盒；Q5 型荧光定量扩增仪。

1.3 方法

1.3.1 检验方法

参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[5]对金黄色葡萄球菌进行检验；参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB /T 4789.14—2014）[6]对蜡样芽胞杆菌进行检验；参照《食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[7]对沙门氏菌进行检验。

1.3.2 细菌培养

①将1#~10#样本前处理后无菌操作分别接种到7.5%氯化钠肉汤等相应的增菌液中增菌，后接种到对应的选择培养基（36±1）℃在培养箱培养24 h，观察结果。②处理好的样品匀液涂布于MYP 平板，置培养箱（30±1）℃培养24 h，观察菌落生长情况。增菌后的培养物接种到金黄色葡萄球菌B-P选择平板、沙门氏菌显色平板，于（36±1）℃培养24 h，观察结果。

1.3.3 涂片镜检

挑取适量可疑典型菌落涂片后固定，用革兰氏染色法染色后镜检。

1.3.4 生化实验

挑取纯培养的菌落分别进行相应的生化实验验证细菌种类。

1.3.5 PCR 检测

5#样本检出的金黄色葡萄球菌用PCR 方法测定肠毒素，取适量单个菌落金黄色葡萄球菌至离心管（生理盐水1 mL）中研磨，置离心机离心5 min（转速12 000 r·min-1），倒掉上清液，留取沉淀；加入DNA 提取液50 μL，用加样枪混匀沉淀使其悬浮，100 ℃温浴5 min，置离心机离心5 min（转速12 000 r·min-1），留上清液待测，使用Q5 荧光定量扩增仪，根据试剂盒说明书设定PCR 反应条件，FAM 通道采集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查情况

2021 年6 月4 日，淄川区疾病预防控制中心接到某医院急诊科报告疑似食物中毒患者2名，根据《食品安全事故流行病学调查技术指南（2012 年版）》[4]赶赴现场展开流行病学处置工作，两人为某校学生，于当日中午在学校宿舍共同进食芒果、网购包装鸡腿、网购面包、柠檬水和可乐鸡米饭，均有头晕、恶心、呕吐、腹痛和精神不佳等症状；呕吐约为3 次/h，1 例伴发热，体温37.6 ℃，平均潜伏期为3.6 h。

2.2 增菌培养与分离结果分析

培养的增菌液和分离的选择平板基上可见5#、6#有可疑菌落生长，其他样本所检项目未检出。5#在Baird-Parker 显色平板上呈圆形、表面光滑、湿润，直径2 ～3 mm 的粉红色菌落，见图1，涂片染色后镜检可见革兰氏阳性的蓝色球菌，呈葡萄串状，血浆凝固酶试验阳性，检测结果是金黄色葡萄球菌；6#在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂上培养后长出微粉色典型菌落，菌落周围有沉淀环，见图2，涂片染色显微镜下见蓝色革兰氏阳性的杆菌，菌体中央有芽孢，为椭圆形，不膨出于菌体，呈链状排列，通过相应的生化实验结果鉴定为蜡样芽胞杆菌，见表1。5#通过PCR 检测肠毒素类型为A 型，见表2。

表1 金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌生化结果

表2 金黄色葡萄球菌肠毒素A-E 分型结果

图1 5#金黄色葡萄球菌 图2 6#蜡样芽胞杆菌

3 结论与讨论

根据现场流行病学调查情况、中毒病例临床症状判断、实验室微生物检测结果综合分析，证实本起事件为细菌性食物中毒，致病菌为金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌，是因网购食品储藏不当所造成的。金黄色葡萄球菌的最适生长繁殖温度为30 ～37 ℃。如果食品加工的任何环节被金黄色葡萄球菌污染，在合适的温度下，金黄色葡萄球菌会在短时间内大量繁殖并产生肠毒素，通过被污染的食物进入人体引起严重的食物中毒[8]。在常见的食源性致病菌中，蜡样芽胞杆菌也是其中之一，该菌引起的食物中毒事件时有发生，严重危害人们的健康[9]。此事件发生在夏季，正值高温季节，两名学生患者食用开封后未冷藏保存的网购面包和鸡腿，因细菌滋生导致食物中毒。建议卫生部门针对社区、学校、企业、养老院和托幼机构等重点场所加强食品健康知识宣传，提高预防食源性疾病的意识；监管部门加强对食品生产和流通行业的督导力度，及时发现安全隐患，从源头上减少食源性疾病的发生。

本文着重从实验室检测方面分析，采集的10 份样品中，仅在5#和6#食物样本中检测到致病菌，而中毒病例的呕吐物中未检测出可疑的致病菌。多年来，在我国的食源性疾病暴发事件中，致病原因不明的急性胃肠炎占20%左右[10-11]，临床症状的相似性导致事件的溯源难度变大，实验室检测尤为重要，实验室检验水平与食源性疾病病因查明密切相关，在开展食物中毒流行病学调查处置时，要注意样品采集和实验室检测的重要性，不断提高检验能力。本次事件的实验室检测多采用传统检验技术，但金黄色葡萄球菌肠毒素类型检测运用了PCR 技术，这也说明基层疾控机构在检验技术方面有了一定发展。随着分子生物学的发展，病原溯源已进入生物信息学时代，通过基因型、分子型或全基因组测序等方法获得更准确的结果，对食源性病原体进行鉴定和事件溯源[12]，这就需要不断学习更新专业技术水平，增强基层实验室的标准化建设，提高食源性疾病致病因子的检出水平，为食源性疾病的溯源提供更精准的技术支撑。