刘春影, 周 婷, 李佳荫,3, 梅 竹, 杨晢铭,3, 张 艳, 刘 丹, 宋海旭

1.北部战区总医院 心血管内科,辽宁 沈阳 110016;2.中国医科大学,辽宁 沈阳 110122;3.东北大学,辽宁 沈阳 110167

骨骼肌为人体最具活力与可塑性的组织之一,约占人体总体质量的40%[1]。作为氨基酸与碳水化合物等重要底物的存储场所,骨骼肌能够产生热量以维持核心温度[2-3]。线粒体为调节骨骼肌能量代谢的重要细胞器,通过调整其体积、结构与功能来应对慢性运动、衰老及疾病等。线粒体为高度动态的细胞器,经历裂变和融合的协调循环,称为“线粒体动力学”,以保持其形状、分布和大小[4-6]。热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)为一种线粒体的分子伴侣蛋白,可维持蛋白质的稳态[7-8]。有研究证实,Hsp60参与多种细胞与组织的线粒体自噬过程,并与骨骼肌线粒体的发生与肌纤维的生成存在相关性[9-10]。本研究旨在探讨Hsp60对骨骼肌线粒体动力学稳态的调控作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5只8周龄雄性健康C57/BL小鼠,体质量20～25 g,购自集萃药康生物有限公司。经北部战区总医院动物管理委员会批准,标准饲养条件,室内温度 22℃,保持 12 h昼夜节律。

1.2 研究方法

1.2.1 C2C12细胞培养与siRNA转染 小鼠成肌细胞系C2C12购自ATCC公司,培养条件为37℃,5%二氧化碳,并应用10%胎牛血清培养液培养。当细胞密度达到80%时,可进行干扰RNA(siHsp60)与对照试剂转染,分别设为siHsp60组与对照组。

1.2.2 免疫荧光染色与MitoTracter染色 小鼠麻醉后,取腓肠肌样本,以4%多聚甲醛固定24 h后脱水、石蜡包埋、脱蜡、伊红染色与乙醇脱水。孵育一抗Hsp60与TOMM20,以4℃过夜。第2天复温30 min,加入荧光二抗,室温避光 1 h。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核,拍照后分析数据。C2C12细胞应用线粒体红色荧光探针染色 15～30 min,染核,拍照分析。

1.2.3 Western blot法 在siHsp60 组与对照组细胞中加入RIPA buffer蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4℃温度下,以12 000 r/min离心10 min。等量样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(120 V,1 h)分离,蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h,孵育一抗。TBST缓冲液清洗3次后,加入二抗孵育2 h,TBST清洗4次,增强型化学发光试剂曝光,分析数据。

1.2.4 透射电镜 采用2%戊二醛将siHsp60 组与对照组细胞在4℃条件下固定24 h。对样品进行不同处理步骤,如固定、梯度乙醇脱水、置换,然后用透射电镜成像,采用iTEM软件对线粒体的数量与大小进行形态测量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hsp60在小鼠骨骼肌与C2C12细胞系线粒体中表达 在小鼠腓肠肌中Hsp60与线粒体膜蛋白标记分子TOMM20有共定位表达(图1a),在骨骼肌成肌细胞系C2C12中同样发现Hsp60与TOMM20有共定位表达(图1b)。

图1 Hsp60在骨骼肌线粒体中表达情况(a.免疫荧光染色检测Hsp60与TOMM20在骨骼肌腓肠肌中表达情况;b.免疫荧光染色检测Hsp60与TOMM20在C2C12细胞中表达情况)

2.2 Hsp60敲减后线粒体形态的变化 与对照组比较,siHsp60 组细胞中异常线粒体的数量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。siHsp60组细胞中线粒体呈点状和碎裂的状态,而对照组细胞中线粒体形态规则,呈长棒状。见图3。

图2 透射电镜检测细胞中异常线粒体的表达(a.透射电镜检测C2C12细胞中线粒体的表达情况;b.统计学分析)

图3 MitoTracker红色探针染色检测细胞中线粒体表达

2.3 Hsp60敲减后线粒体动力蛋白的表达变化 Western blot法检测结果发现,与对照组比较,siHsp60组细胞中线粒体融合蛋白(optic atrophy 1,OPA1)表达量显著降低,而线粒体分裂与融合蛋白即动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 线粒体蛋白OPA1与DRP1表达情况(a.Western blot法检测线粒体中OPA1与DRP1蛋白的表达情况;b.统计学分析)

3 讨论

线粒体在细胞中起到重要作用,包括调控能量供应、Ca2+稳态与细胞凋亡等。骨骼肌细胞通过线粒体动力学(融合与裂变)等途径维持线粒体的形态与生理学功能[11-12]。年龄引发的骨骼肌萎缩为世界范围内的一个主要健康问题[13]。线粒体动力学损伤为导致骨骼肌萎缩的主要机制之一。

本研究结果显示,Hsp60在骨骼肌纤维与C2C12细胞系的线粒体中大量表达。这提示,Hsp60可能在线粒体的生物活性中发挥重要作用。Hsp60作为一种线粒体蛋白,在调节线粒体蛋白稳态中起到关键作用[14]。有研究报道,Hsp60不仅定位线粒体,在细胞质、质膜和胞外,以及血液循环中均有表达,不仅调控线粒体伴侣活性,还在细胞增殖、凋亡、迁移和免疫应答等多种细胞过程中发挥作用[15-16]。在C2C12细胞中给予Hsp60敲减后,透射电镜发现胞质中异常的线粒体数量增加,MitoTracker红色探针染色检测发现线粒体的形态发生改变,分裂的线粒体数量增多。线粒体为一个动态细胞器,不断发生裂变和融合,以使其形态适应细胞环境。本研究Western blot法检测结果发现,与对照组比较,siHsp60组细胞中OPA1表达量显著降低,而DRP1表达量显著升高(P<0.05)。这提示,Hsp60减少可引起线粒体动力蛋白的表达异常。有研究证实,Mfn1与 Mfn2双基因骨骼肌特异性敲除的小鼠骨骼肌中线粒体破坏,骨骼肌运动功能严重损伤[17-20]。OPA1的特异性敲除同样会导致骨骼肌线粒体功能障碍、氧化应激反应和炎症等。骨骼肌特异性DRP1基因敲除会引起骨骼肌萎缩,再生障碍。

综上所述,Hsp60作为线粒体伴侣蛋白,可能参与维持线粒体的动力学稳态,在骨骼肌萎缩等病理过程中发挥重要作用。