张昂　李丽华　钟壹鸣　钟大玲　秦晓威　吉训志　周艳飞　鱼欢

关键词：橡胶树；香露兜；间作；香气成分；土壤；理化性质

中图分类号：S344.2 文献标识码：A

橡胶林是中国热带地区最大的热带经济林[1]，其产物天然橡胶是我国重要的战略物资[2]。橡胶林主要分布于云南、海南等热带地区，其株行距宽广，适宜发展林下经济[3]。香露兜（Pandanusamaryllifolius Roxb.）是露兜树科（Pandanaceae）露兜树属（Pandanus）特色香料草本植物，又名斑兰叶，原产于印度尼西亚，20 世纪50 年代引入中国，种植面积约333 hm2[4]。香露兜叶片具有独特的粽香香气，经济价值高且粗生易种，其光饱和点在550～600 μmol/（m2·s）之间，适宜在林下弱光照的环境中种植[5]。因此，大力发展橡胶林下间作香露兜有助于提高橡胶林经济产值，促进农民增收，以及乡村振兴战略实施。

香露兜叶片含有的大量挥发性香气成分，主要由醇类、芳香类、羧酸类、酮类、醛类、酯类、烃类、呋喃类、萜类等化合物种类组成[4-5]。其中吡咯类，如2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）是香露兜的主要香气成分，也是评价香露兜品质优劣的主要参考指标。2AP 香气成分在水稻、爆米花、香水椰子中同样含有[6]，但香露兜2AP 含量是芳香型水稻的10 倍，非芳香型水稻的100 倍[7]，具有广阔的开发前景。前期研究表明，2AP 等稻米香气物质受环境因子如光照、土壤湿度、矿物质离子、氮肥等显著影响[8]，LUO 等[9]在芳香型水稻研究中发现硒的施用可提高2AP 生物合成速率。此外，香露兜叶片中含有大量天然活性物质如角鲨烯、亚油酸、叶绿醇等同样受到环境因子调控，例如土壤中镁元素缺乏或土壤盐胁迫能够引起香露兜活性物质含量的显著降低[10-11]。

橡胶间作香露兜具有传统复合种植模式的优势，即间作作物之间会产生协同互补效应，使作物生理性状、产量和品质发生改变[12]。例如前人研究发现，在茶园间作乔木体系中，乔木通过改善光合生态环境，提高土壤养分和土壤酶活性，减少茶树光合午休和养分供应不足等现象，显著增加茶中氨基酸和咖啡碱含量，提高茶叶品质[13]；李枝桦等[14]在烟草与香料间作种植中发现，烟草与香料作物间作形成化感物质，导致烤烟增加许多新的致香成分；在槟榔与香露兜间作模式中发现，间作香露兜香气成分组成与单作相比差异较小，但香气成分含量显著增加[4]。然而，橡胶间作香露兜对香露兜香气成分的影响目前尚未报道，探究橡胶间作香露兜对香露兜叶片香气成分组成和含量的影响及其关键调控因子，能够为优化橡胶间作香露兜模式提供理论基础，有助于推广橡胶与香露兜复合栽培模式，促进相关产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

试验位于中国热带农业科学院香料饮料研究所种质资源圃（18°44′15″N，110°11′32″E），该地区属于热带季风气候，年平均温度在23～24 ℃，大于或等于10 ℃的积温6655.7～9855.4 ℃。年平均降水量2100～2200 mm，其中8—10 月雨量占年雨量的40%～50%。年平均日照為1500～2200 h。

选取生长状态基本一致，健康无病虫害培育半年的香露兜植株和培育一年的橡胶植株作为试验材料。试验用土为以砖红壤为主混合而成的质地均一的土壤。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 选取直径35 cm，高50 cm 的圆形花盆进行盆栽试验。橡胶定植于2020 年10月，一个月以后再进行香露兜定植。观测时间为2021 年11 月。试验设计香露兜单作（M）和橡胶香露兜间作（I）2 个处理，每个处理重复10次。试验期间采用相同的水肥管理措施。

1.2.2 指标测定 （1）土壤养分含量测定。于2021 年11 月采用环刀法采集土壤样品，一个完整的环刀土壤样品在105 ℃下烘干称重，并计算土壤容重（soil bulk density， SBD），计算公式：SBD = 烘干土样质量/环刀容积。其余土壤样品在实验室避光晾干，研磨过16 目筛（1 mm），采用电位法测定土壤pH；使用硫酸提取-钼兰比色法测定土壤速效磷（soil olsen phosphorus， SOP）含量；采用醋酸铵-火焰光度计法测定土壤速效钾（soil available potassium， SAK）含量；采用碱解扩散法测定碱解氮（soil alkali hydrolyzed nitrogen，SAN）含量。（2）环境指标测定。使用多参数土壤水分速测仪（TZS-2X-G）测土壤温度（soiltemperature， ST）、土壤湿度（soil moisture， SM）、电导率（conductivity， Cond）。（3）香气成分测定。a. 萃取方法。与土壤样品采集同期，每个处理随机选取10 株香露兜，采集倒5～7 叶位的新鲜叶片，用去离子水冲洗干净叶面杂质后，用洁净的纱布擦拭叶表面水分，室内静置5 min 待其叶片表面水分挥发完全，环境温度为（20 ± 3） ℃。剪碎并称取4 g 鲜叶样品于50 mL 离心管中，加入15 mL 无水乙醇， 使用数控超声波清洗器（KQ5200DE）在400 W、40 KHz、50 ℃下超声波萃取60 min，用0.22 μm 有机相针式滤器（尼龙）过滤，获取提取液，使用Aglient-7890 B/5977B气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）进行检测。b. 气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析。色谱（GC） 条件： 色谱柱为弹性石英毛细管柱DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以1 mL/min的高纯氦气（99.999%）为载气，不分流进样，进样口和接口温度为250 ℃。色谱柱初始温度为50 ℃，保持2 min 后，以5 ℃/min 的升温速度升温至100 ℃，再以6 ℃/min 的速度升温至250 ℃，保持5 min。质谱（MS）条件：离子源为EI，温度230 ℃。四极杆温度为150 ℃，进样口温度为250 ℃，电压为70 eV，扫描质量范围在30～ 450 amu。

1.3 数据处理

1.3.1 香气成分数据分析 （1）定性分析。结合质谱和保留指数对香露兜香气成分进行定性，质谱分析结果在NIST2017 谱库中进行检索，对比定性；以相同条件使用C7～C40 正构烷烃混标（上海安谱实验科技有限公司），进行GC-MS 分析，利用其保留时间按线性方程计算各成分的保留指数，对实测计算的保留指数与文献进行定性分析。

（2）定量分析。精密吸取角鲨烯标准品（GC≥98%，上海源叶生物科技有限公司）、叶绿醇标准品（GC≥90%，上海源叶生物科技有限公司）、2-乙酰-1-吡咯啉标准品（纯度95%， torontoresearch chemicals， Canada）以及甲醇（色谱纯），分别配置50、100、150、300、500 μg/mL 溶液浓度，以样品的色谱条件，标准品浓度由低到高的顺序依次进样，每个浓度进样3 次，得到各组分的定量线性关系图表，横坐标为各组分梯度浓度，纵坐标为3 次测定峰面积的平均值。利用峰面积按照线性方程计算角鲨烯、叶绿醇、2AP 的含量，同时再根据2AP 的含量对其他香气物质进行半定量。计算公式：

X_i=（A_i / A_s）×C_s

式中，X_i为待测物质含量；A_i为待测物的峰面积；A_s为2-乙酰-1-吡咯啉的峰面积；C_s为样品中2AP含量。

1.3.2 数据统计分析 使用R 4.0.1 软件对香气成分种类及含量进行单因素方差分析，用于判断间作对香气成分种类及含量的影响，而后对香气成分种类及含量样本进行聚类（NMDS）分析，用于明确间作对香露兜香气成分的影响。使用Canoco 4.5软件对不同环境因子和香露兜香气成分种类及含量进行CCA 分析，并使用Origin 2021软件进行环境因子和香气成分种类之间的相关性分析并作图，用于明确间作影响香露兜香气成分的关键调控因子。

2 结果与分析

2.1 间作对香露兜土壤环境因子的影响

由单因素方差分析（表1）可知，间作与香露兜单作相比，土壤pH 降低1.00，土壤容重（SBD）、碱解氮（SAN）、土壤速效磷（SOP）、土壤速效钾含量（SAK）分别提高13.63%、59.71%、193.03%、9.78%（P<0.05）。间作对土壤湿度（SM）、土壤温度（ST）、电导率（Cond）无影响。

2.2 间作对香气含量物质组成的影响

间作和单作共检测出68种挥发性香气成分，间作检测出44 种，单作检测出61 种。由表2 可见，间作香露兜的酮类、呋喃类、呋喃酮类、烃类和酚类的物质种类与香露兜单作相比分别减少56.52%、14.29%、33.33%、20.00%、28.57%（P <0.05）。间作对醇类、呲咯类、酯类、醛酮类、酸类等成分种类无影响。

由表3可见，间作处理中，香气成分含量最多的为醇类，单作香气成分最多为烃类。间作香露兜香气成分含量：醇类＞烃类＞呋喃酮类＞呲咯类＞呋喃类＞酯类＞酸类＞酚类＞酮类＞醛酮类。单作香露兜香气成分含量：烃类＞醇类＞呋喃类＞呋喃酮类＞酚类＞酯类＞呲咯类＞酸类＞酮类＞醛酮类。橡胶香露兜间作与香露兜单作相比分别提高醇类、呲咯类、酯类和呋喃酮类香气成分含量31.50%、597.56%、122.78%、96.89%（P<0.05），并且显著降低呋喃类65.28%、烃类20.88%和酮类69.00%的香气成分含量（P<0.05），却对醛酮类、酸类、酚类香气成分含量无影响。

2.3 间作对香露兜香气成分的影响NMDS分析

对香气成分种类（胁强系数stress=0.027）和含量（stress=0.079）分别进行NMDS 分析，由图1 可知，间作处理下香露兜香气成分组成和含量的重复性较单作更好，单作与间作处理下的香露兜香气成分组成（stress=0.109）和含量（stress=0.079）均能准确反映数据排序的真实分布，并且单作与间作处理下的香露兜香气成分组成和含量均存在明显差异。

2.4 影响香气成分组成和含量的主要土壤环境因子CCA分析

对香露兜香气成分组成和土壤环境因子进行CCA 分析，结果显示所有土壤环境因子共同解释了间作后香露兜香气成分组成变化的23.17%。CCA 分析前2 个排序轴分别解释总方差的16.70%和6.47%（图2）。影响香露兜香气成分组成的主要土壤环境因子为土壤pH（F=2.20， P<0.05）、土壤速效磷（F=2.00， P<0.05）

香气成分含量和土壤环境因子CCA 分析结果显示，所有土壤环境因子共同解释了间作后香露兜香气成分含量变化的55.58%，前2 个排序轴分别解释总方差的47.59%和7.99%（图3）。土壤pH（F = 11.70， P<0.001）、土壤速效磷（SOP，F=11.60， P<0.001）、土壤碱解氮（SAN， F=7.10，P<0.001）、土壤容重（SBD， F=6.00， P<0.001）和土壤温度（ST， F=3.10， P<0.05）等5 个指标是影响香露兜香气成分含量的主要土壤环境因子。

2.5 影响香气成分组成和含量的主要因素

通过相关性分析（图4A）可知，土壤温度与醇类（R=?0.402， P<0.05）组成呈显著负相关关系；电导率与呋喃类（R=0.581， P<0.01）组成呈显著正相关关系；土壤pH 与酮类（R=0.488， P<0.05）、呋喃类（R=0.480， P<0.05）、呋喃酮类（R=0.638，P<0.01）、烃类（R=0.529， P<0.05）和酚类（R=0.398，P<0.05）組成呈显著正相关关系；土壤容重与醛酮类（R=?0.509， P<0.05）组成呈显著负相关关系；土壤速效钾与烃类（R=?0.595， P<0.01）和酚类（R=?0.450， P<0.05）组成呈显著负相关关系；土壤碱解氮与酮类（ R=?0.552， P<0.05） 、呋喃酮类（R=?0.499， P<0.05）、烃类（R=?0.570， P<0.01）和酚类（R=?0.404， P<0.05）组成呈显著负相关关系；土壤速效磷与酮类（R=?0.506， P<0.05）、呋喃类（R=?0.463， P<0.05）、呋喃酮类（R=?0.514，P<0.05）、烃类（R=?0.581， P<0.01）和酚类（R=?0.452， P<0.05）组成呈显著负相关关系。

土壤湿度与醇类（R=?0.403， P<0.05）含量呈显著负相关关系；土壤温度与酮类（R=0.606， P<0.01）和呋喃类（R=0.476， P<0.05）含量呈显著正相关关系；电导率与呋喃类（R=0.420， P<0.05）和烃类（R=0.571， P<0.01）含量呈显著正相关关系；土壤pH 与呋喃类（R=0.600， P<0.01）、烃类（R=0.449， P<0.05）和酚类（R=0.459， P<0.05）含量呈显著正相关关系，与醇类（R=?0.440， P<0.05）、呲咯类（R=?0.824， P<0.01）、酯类（R=?0.644， P<0.01）和呋喃酮类（R=?0.599， P<0.01）含量呈显著负相关关系；土壤容重与呲咯类（R=0.599， P<0.01）、酯类（R=0.546， P<0.05）和呋喃酮类（R=0.582， P<0.01）含量呈显著正相关关系，与醛酮类（R=?0.465， P<0.05）、呋喃类（R=?0.497，P<0.05）含量呈显著负相关关系；土壤速效钾与酯类（R=0.518， P<0.05）含量呈显著正相关关系；土壤碱解氮与醇类（R=0.428， P<0.05）、呲咯类（R=0.731， P<0.01）、酯类（R=0.569， P<0.01）和呋喃酮类（R=0.608， P<0.01）含量呈显著正相关关系，与呋喃类（R=?0.467， P<0.05）含量呈显著负相关关系；土壤速效磷与呲咯类（R = 0.830，P<0.01）、酯类（R=0.684， P<0.01）和呋喃酮类（R=0.645， P<0.01）含量呈显著正相关关系，与呋喃类（R=?0.547， P<0.05）、烃类（R=?0.460， P<0.05）含量呈显著负相关关系（图4B）。

3 讨论

3.1 间作对土壤理化性质的影响

间作是一种能够改善土壤生态环境的种植模式[15]，已有研究表明，间作能够显著影响土壤理化性质[16]，如李杨辉等[17]在苹果间作苜蓿后发现土壤pH 显著降低。在本研究中，橡胶香露兜间作同样降低土壤pH，这可能与橡胶根际分泌物产生大量十六烯酸、油酸等物质有关[18]。土壤容重大小可以反映出土壤孔隙度、田间持水量等土壤物理性质[19]，一般情况下与土壤有机质呈负相关关系[20]。前期研究发现在香蕉[21]和玉米[22]等间作体系中土壤容重呈降低趋势，但本研究中间作使土壤容重增加，而土壤含水量并无差异，这可能是由于间作香露兜后橡胶林土壤有机质含量显著降低，土壤团聚体被破坏所致[23]。土壤速效养分是植物从地下部最易获取的养分[24]，刘在民等[25]在苜蓿/大白菜间作模式下发现间作与单作相比土壤速效养分含量显著提高，在本研究同样能够证实上述结果。首先，土壤pH 的变化会影响土壤中离子交换过程[26]，间作后土壤pH 降低使磷、钾等离子交换发生改变，加速土壤养分累积[27]；其次，间作后作物土壤菌群改变，土壤菌群的改变增强土壤磷酸酶、过氧化氢酶等酶活性[28-29]，加速土壤中氮、磷、钾的释放，提高土壤速效磷、土壤速效钾、土壤碱解氮含量。众所周知，土壤养分是植物生长发育的重要养分来源，土壤养分等理化性质的改变将直接影响植物对养分的吸收和利用效率，显著影响植株的生长发育以及品质形成[30]。因此，土壤理化性质和养分条件的变化可能是显著调控香露兜香气成分的主要原因之一。

3.2 间作对香气成分组成的影响

香露兜是一种热带香料作物，香气成分是其次生代谢产物， 主要分布在叶片[31-32]。运用GC-MS 技术比较分析不同种植模式下香露兜香气成分组成和含量的变化规律，结果发现，香露兜香气成分由醇类、呲咯类、酮类、酯类、醛酮类、呋喃类、呋喃酮类、酸类、烃类、酚类等10类物质组成[33]。在前期相似的研究中发现烟草在间作模式中显著增加新的致香物质主要与土壤理化因子的变化密切相关[14]。土壤中养分含量的变化通过影响作物对养分的吸收速率，进而调控某些香气成分前体物质的合成和基因的表达，造成香气成分组成发生改变[34]。本研究结果证实土壤pH、土壤容重、土壤速效磷是主要影响香露兜香气成分组成的主要环境因子。土壤速效磷与酚类、烃类、呋喃类、呋喃酮类、酮类物质组成均呈显著负相关关系表明，间作处理下适宜的光合有效辐射以及土壤速效钾和磷等土壤养分含量的增加可能改变了香露兜生长速率与香气成分合成的平衡关系，通过加速香露兜的营养生长，抑制部分香气成分的合成路径，进而减少香气成分种类[33-35]。本研究中，pH 与酮类、呋喃类、呋喃酮类、烃类和酚类的香气成分组成数量呈正相关关系表明，土壤pH 的降低通过抑制植物对土壤养分的吸收[35]及其基因表达[27]是使酮类、呋喃类、呋喃酮类、烃类、酚类香气成分组成减少的另一个主要因素。

3.3 间作对香露兜香气成分含量的影响

OKPALA 等[36]、LUO 等[37]、XIE 等[38]在香稻试验中发现，环境因子对香米的香气成分含量有显著影响。在槟榔间作香露兜的研究中发现，光合有效辐射同样是调控香露兜香气成分含量的主要因素。但在本研究中，影响香露兜香气成分含量的主要环境因子是土壤pH、土壤容重、土壤碱解氮和速效磷含量。究其原因，首先，前人研究认为土壤pH 变化是影响作物品质产生的主要因子之一[39]，在本研究中，土壤pH 与醇类、呲咯类、酯类、呋喃酮类含量呈负相关关系，却与呋喃类和烃类含量呈显著正相关关系，可能是由于pH降低调控土壤细菌种类及土壤酶活性变化[40-41]，影响土壤中含有氮磷钾等有机质的矿化速率，进而改变香露兜的养分吸收速率[42-43]，使醇类、呲咯类和酯类香气成分含量增加，呋喃类和烃类香气成分含量降低；其次，氮和磷是作物促进香气成分物质合成和代谢的主要元素之一[24， 44]。有研究指出土壤中的氮和磷含量缺乏会降低烟叶中部分与香气成分相关的次生代谢产物合成，进而减少部分香气成分含量[42， 45]。本研究结果与上述研究保持一致，即土壤碱解氮和速效磷与香露兜香气成分呲咯类、酯类和呋喃酮类含量呈显著正相关，间作处理下土壤速效磷含量的增加显著促进醇类、呲咯类、酯类和呋喃酮类等香气成分含量的提高。然而，间作后提高土壤速效磷含量却可能抑制呋喃类和烃类的前体物质的合成。综上所述，橡胶间作香露兜模式通过显著降低土壤pH，以及提高土壤碱解氮和速效磷含量，显著促進醇类、呲咯类、酯类和呋喃酮类等香气成分含量的提高，以及呋喃类和烃类物质含量的下降。

呲咯类物质中的2AP 是香露兜棕香香气的主要来源，也是评价香露兜品质好坏的主要参考依据，在本研究中发现橡胶香露兜间作显著提高呲咯类物质含量，表明间作对香露兜品质的提高有显著促进作用。但以上研究仅对间作模式下香露兜香气成分与环境因子间的关系进行初步探讨，间作模式对香露兜2AP 物质合成路径，及相关基因表达的作用机制还有待进一步探究。

4 结论

橡胶间作香露兜后，土壤pH 降低是香露兜叶片酮类、呋喃类、呋喃酮类、烃类和酚类等香气组分减少的主要原因；间作模式在通过降低pH、提高土壤速效磷和碱解氮含量，显著提高醇类、呲咯类、酯类含量的同时，减少呋喃类、烃类含量。呲咯类物质是香露兜棕香香气的主要来源，间作模式对香露兜品质的提高有显著促进作用。优化和推广橡胶间作香露兜模式有助于提高胶农收益以及相关产业的可持续发展。