许振民，陈子钊，崔海涛，王中铎，郭昱嵩,2

（1.广东海洋大学水产学院南海水产经济动物增养殖重点实验室/2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088）

体色是脊椎动物最具多态性的特征之一，是鱼类适应性进化的重要表现。在消费市场上，鱼类体色是鱼身体健康的标志和评判鱼质量的重要标准，多样化的体色使得经济鱼类的观赏价值更高。鱼类皮肤颜色主要源自黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞及一些复合色素细胞[1,2]。斑马鱼（Danio rerio，蓝色和银色）、鳜（Siniperca chuatsi，棕黄色）和豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus，黑色或红色）等鱼类色素细胞类型相同，但体色模式不一样[3-5]。色素细胞发育受KIT（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Kit）、集落刺激因子、白细胞酪氨酸激酶和内皮素等介导的多条信号通路调控，且神经和内分泌系统控制着体色的变化[6-11]。在物质组成上，皮肤颜色依赖于色素细胞内储存的色素颗粒，红/黄/橙色通常由蝶啶和类胡萝卜素的积累所致，斑马鱼成鱼黄橙色的依赖性物质是类胡萝卜素[12-14]。

红鳍笛鲷（Lutjanus erythropterus）隶属鲈形目笛鲷科，广泛分布于热带和亚热带的近岸和岩礁海区，是我国南海重要经济鱼类，其成鱼体色呈红色或粉红色，背部颜色较深，腹部颜色较淡，体表拥有过眼条纹和尾部黑斑（https://fishbase.org）。鲜红的体色是红鳍笛鲷的重要形态和经济特征。养殖鱼由于缺乏膳食类胡萝卜素来源，体色往往比野生鱼暗淡，因此，通常在饲料中添加类胡萝卜素以改善经济鱼体色。如，虾青素、角黄素、叶黄素和螺旋藻等类胡萝卜素着色剂可增加大黄鱼（Larimichthys crocea）、金赤鲷（Pagrus auratus）、大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）和杂交黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）的组织类胡萝卜含量和皮肤色度[15-20]，但未见红鳍笛鲷的有关报道。

本研究拟评估红鳍笛鲷不同部位皮肤颜色，结合石蜡切片、冰冻切片和电镜切片揭示红鳍笛鲷色素细胞形态、组成和分布规律，研究类胡萝卜素与红皮肤的呈色关系，为揭示红鳍笛鲷红体色形成机制和进一步改善养殖鱼体色提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用的红鳍笛鲷为购自湛江市霞山水产品批发市场的养殖鱼。体长（30.70±2.94）cm，体质量（680.82±168.45）g。

1.2 体色观察

实验鱼经MS-222 麻醉，拭干体表水分，用相机（Canon EOS 550D）拍 照，并用色差仪（3nh NR60CP）测定皮肤体色值，样本数为19尾。测定部位，背鳍前缘下方、侧线鳞上方皮肤，腹鳍至臀鳍间皮肤，尾柄处皮肤。测定前进行色差仪白板校正，每个位置测定2 次，第2 次测量探头旋转180°，记录体色值。

取相同大小的3 个部位皮肤，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，置于显微镜（Nikon ECLIPSE Ni-E）下观察，随机选取30 个视野统计色素细胞数量，计算平均单位面积下的黑色素细胞和红色素细胞数量，用ImageJ v1.8进行统计分析。

1.3 组织学观察

对1.2 的皮肤组织进行石蜡切片、冰冻切片和透射电镜切片。石蜡切片用Bouin 氏固定液固定、HE 染色，切片厚度5 μm；冰冻切片组织置于-20 ℃恒温下冰冻，经蔗糖脱水和OCT（Optimal cutting temperature）包埋等步骤制成冰冻切片，切片厚度4～6 μm；透射电镜切片组织经固定、脱水、包埋和醋酸铀-柠檬酸铅双染色，使用电子显微镜（JEM-1400）观察。

1.4 总类胡萝卜素含量测定

总类胡萝卜素含量（TCC）测定参考姚金明[20]方法进行。分别准确称取皮肤、肠、肌肉、肝脏、视网膜和脾脏各0.1000 g，加入等质量无水硫酸钠和1 mL 丙酮，匀浆，补充丙酮至容积为10 mL，于4 ℃下避光孵育3 d。以4 000 r/min 离心10 min，取上清液，以丙酮为空白对照，在473 nm 下测定各组织提取液的光密度值。TCC质量分数（μg/g）计算：

式中，D为丙酮相在473 nm处的光密度值；K为常数（104）；V为提取液体积（mL）；E为摩尔消光系数，数值为2 500；G是样品质量（g）。

1.5 液相色谱-质谱/质谱串联法（LC-MS/MS）测定皮肤类胡萝卜素含量

类胡萝卜素含量参考Krinsky等[21]和Geyer等[22]的方法以液相色谱和质谱法测定。分别取1.2 中背部、腹部皮肤以及侧线鳞下方（体侧）皮肤，用研磨仪研磨（30 Hz，1 min）至粉末状，称取50 mg 研磨后粉末，用0.5 mL 含0.1 g/L 2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）的正己烷-丙酮-乙醇等体积混合液提取类胡萝卜素，室温下涡旋20 min，以4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清，重复提取1 次，离心，合并上清液，将得到的提取液浓缩，用100 μL 体积比1∶1 的甲醇/甲基叔丁基醚混合液复溶，过0.22 μm 滤膜后，保存于棕色进样瓶，由迈特维尔生物科技有限公司（武汉）进行LC-MS/MS分析。

1.6 数据处理

利用SPSS 22.0 软件通过单因素方差分析比较体色值和总类胡萝卜素含量数据，显著性水平设为0.05。

2 结果和分析

2.1 红鳍笛鲷皮肤颜色差异

表1 显示，腹部皮肤最亮（P＜0.05），背部皮肤最暗（偏黑）（P＜0.05），尾部皮肤最黄（P＜0.05），而尾部和腹部皮肤红色值无显著差异，且均显著红于背部皮肤。

表1 红鳍笛鲷不同部位皮肤颜色值比较Table 1 Comparison of skin color values for different parts of Lutjanus erythropterus

不同部位皮肤的色素细胞数量结果（图1）显示，各部位皮肤红色素细胞密度显著高于黑色素细胞密度（P＜0.001），腹部皮肤中黑色素细胞数量稀少，甚至没有。

图1 红鳍笛鲷不同部位皮肤黑色素细胞和红色素细胞密度比较Fig.1 Comparison of chromatophore density in different parts of Lutjanus erythropterus

2.2 红鳍笛鲷皮肤色素细胞的组织分布

形态学观察结果显示，背部皮肤和尾部皮肤均含有4 种色素细胞，即黑色素细胞和红色素细胞交替分布，黄色素细胞和虹彩细胞位于下层；腹部皮肤主要包含红色素细胞和虹彩细胞。组织学观察结果显示，皮肤由表皮和真皮组成，表皮由5～8 层细胞组成，表皮中层含有较多颗粒细胞，表皮下层有1～2 层杯状细胞，而色素细胞紧密排列在真皮层，并形成两条连续的色素带，分别位于表皮与鳞片之间和真皮致密层顶部。背部和尾部皮肤中均可见黑色素细胞。冰冻切片显示了黄色素细胞的分布，虹彩细胞从背部向腹部呈增加趋势。透射电镜结果显示，背部皮肤中含有较多黑色素颗粒，与类胡萝卜素油滴和反射小板相间分布，尾部皮肤中反射小板紧密分布于黑色素颗粒和类胡萝卜素油滴下方，腹部皮肤中分布着大量反射小板（图2）。

图2 红鳍笛鲷皮肤形态学和组织学观察Fig.2 Morphological and histological characteristics in the skin of Lutjanus erythropterus

2.3 红鳍笛鲷不同组织的类胡萝卜素含量

图3显示，类胡萝卜素在各组织中均有分布，但主要沉积在皮肤中，其次是视网膜。体侧皮肤和背部皮肤中总类胡萝卜素含量显著高于其他部位皮肤（P ＜0.05）；尾部皮肤、腹部皮肤和视网膜中的含量显著高于肠和肌肉（P ＜0.05）；肠、肝脏和脾脏中含量无显著差异（P ＞0.05），肌肉中含量最低（P ＜0.05）（图3）。

图3 红鳍笛鲷不同组织总类胡萝卜素含量比较Fig.3 Comparison of total carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

液相色谱和质谱结果表明红鳍笛鲷皮肤含68种类胡萝卜素中的16 种，其中，背部皮肤含13 种，体侧皮肤11 种，腹部皮肤7 种。皮肤中类胡萝卜素主要以类胡萝卜素酯的形式存在，其中叶黄素酯最为丰富，但未检出游离的叶黄素单体。黄色类胡萝卜素包括叶黄素酯、玉米黄质酯、紫黄质酯，β-隐黄质油酸酯和玉红黄质棕榈酸酯。红色类胡萝卜素包括虾青素、角黄素和β-柠乌素，其中虾青素和角黄素2 种红色类胡萝卜素均存在于3 个部位皮肤，并呈线性数量差异（图4）。

图4 红鳍笛鲷不同部位皮肤类胡萝卜素含量比较Fig.4 Comparison of carotenoid contents in different tissues of Lutjanus erythropterus

3 讨论

3.1 色素细胞和体色的关系

鱼类丰富多彩的体色是由色素细胞间相互作用所致，受到色素细胞种类、数量和排布方式的影响。色素细胞起源于神经嵴，并分布于皮肤真皮层，在鳜表皮中亦发现少量色素细胞。通过透射电镜发现，斑马鱼的皮肤色素层依次为黄色素细胞、虹彩细胞和黑色素细胞，蓝色条纹区域存在两种排布方式的虹彩细胞[3]。鳜棕黄色皮肤的表层色素细胞为黄色素细胞，图案区域含有大量连续分布的黑色素细胞[4]。豹纹鳃棘鲈皮肤中红色素细胞和黑色素细胞均匀分布在真皮层，且红色个体的红色素细胞比黑色个体更多[5]。这说明表层色素细胞的分布特征对体色有重要的决定作用，皮肤图案和呈色深浅受色素细胞数量的影响，即图案区域和颜色较深的部位色素细胞数量越多，分布越密集。本研究中，红鳍笛鲷皮肤的色素细胞分布在真皮层顶部，红色素细胞和黑色素细胞交替分布在色素带表层，红色素细胞的数量优势使得红鳍笛鲷呈现红体色，这与豹纹鳃棘鲈体色变异个体中色素细胞的分布特征较为相似。然而，红色度与红色素细胞数量无明显关系，主要受黑色素细胞分布情况的影响。水产动物的体色与色素细胞发育、分化及调控有关，不同发育阶段的体色模式存在差异。红鳍笛鲷在胚胎发育过程中已分化出黑色素细胞，黄色素细胞见于2日龄的仔鱼，最早在鳃盖上发现了虹彩细胞，在鱼鳍上看见红色素细胞[23,24]。因此，红体色分布存在阶段性，色素的沉积主要依赖于色素细胞的生长与发育情况。

3.2 类胡萝卜素含量与体色的关系

红色、黄色和橙色通常由类胡萝卜素积累所致。类胡萝卜素是由植物、一些细菌和真菌合成的脂溶性化合物，鱼类只能通过摄食获得。目前已发现天然类胡萝卜素1 000多种，根据颜色可分为红色类胡萝卜素和黄色类胡萝卜素，这些类胡萝卜素的含量差异影响着水生动物的呈色[12]。鱼类总类胡萝卜素含量存在组织差异。大西洋鲑（Salmo salar）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等鲑科鱼类的肌肉总类胡萝卜素含量较高，而大黄鱼主要沉积在皮肤中[19]。类胡萝卜素对水生生物有调节生长、增强免疫力、抗氧化和改善视力等作用。叶黄素和玉米黄质主要积累在眼睛黄斑中，可减免蓝光和近紫外光对视网膜的损害，玉米黄质可提高斑马鱼的视力[25]。叶黄素可改善日本沼虾（Macrobrachium nipponense）的生长性能和免疫活力[26]，提升金鱼（Carassius auratus）幼鱼的存活率以及改善黄颡鱼的生长性能[17,27]。哺乳动物较易从食物中获得类胡萝卜素，而鱼类会优先使用叶黄素，满足其对维生素A 的需求。维生素A 有维持眼睛正常视觉、上皮组织正常生长与分化，调节免疫和骨骼发育的作用[28]。摄食类胡萝卜素还可提升鱼类皮肤的色泽。Yi 等[16]研究表明，大黄鱼皮肤的类胡萝卜素含量、黄色度和红色度与饲料中叶黄素和角黄素的比例呈线性相关，角黄素含量越高越利于皮肤发红。角黄素和虾青素均有增加红剑鱼（Xiphophorus helleri）红色的作用，而虾青素的增色效果更明显[15]。本研究中，类胡萝卜素主要沉积在红鳍笛鲷视网膜和皮肤组织中，叶黄素和玉米黄质等黄色类胡萝卜素在皮肤中最为丰富，一方面可满足皮肤组织细胞生长、免疫和抗氧化方面的需求，另一方面满足了红或黄色素细胞对黄色类胡萝卜素的着色供应。黄色类胡萝卜素主要沉积在背部和体侧皮肤中，而腹部皮肤同样分布着红色素细胞，类胡萝卜素类型却不一致，这进一步说明红色由红色类胡萝卜素提供。然而，虾青素等红色类胡萝卜素所占比例极小。这可能意味着红色呈色对红色类胡萝卜素的需求量不高，或是天然虾青素多以虾青素酯形式存在[29]。鱼类除可将摄入的类胡萝卜素直接用于体色呈色外，还可对摄入的类胡萝卜素进行分子修饰并产生新的衍生物类型。例如，鲤科鱼类可通过氧化修饰作用将玉米黄质转化为虾青素，但鲑鱼不能通过代谢修饰合成虾青素[30]。综上，类胡萝卜素是鱼类呈色必不可少的物质，虾青素和角黄素可改善红色经济鱼类的体色，但红色类胡萝卜素在鱼类体内的代谢调控机制尚不清楚。

4 结论

红色素细胞的数量优势及其在色素带表层分布的特征是红鳍笛鲷红体色形成的重要原因。红鳍笛鲷体内的类胡萝卜素主要沉积在皮肤和视网膜中，虾青素和角黄素2 种红色类胡萝卜素与红体色密切相关。本研究结果为红鳍笛鲷养殖鱼体色的改善研究提供参考，可进一步在饲料中补充虾青素和角黄素以提升红色。