荣 云，高 菲，王海青，许 强，冯博轩，孙春阳，郝 雨

（海南大学：1.海洋学院/2.生态与环境学院/3.南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228）

华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）为暖水性贝类，隶属软体动物门瓣鳃纲珍珠贝目扇贝科，我国主要产于广东、广西和海南等南部沿海地区[1]，是我国规模化养殖产业之一[2-3]。近年来，由于人类活动不断增强，极端温度和海洋低氧事件频发，导致华贵栉孔扇贝大规模死亡事件频发。受到外界环境胁迫时，贝类可通过生理活动的调整重建内稳态。

神经内分泌系统是机体应对胁迫的调控中枢，当贝类感受到胁迫后，其神经内分泌系统将分泌儿茶酚胺、神经肽等神经递质以应对外界环境变化，导致循环生理方面发生相应的变化。儿茶酚胺类激素是神经内分泌系统重要信号分子，主要包括去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）、肾上腺素（Epinephrine，E）和多巴胺（Dopamine，DA），在贝类的多种生理过程中起重要作用[4-12]。循环系统生理学指标可反映生物代谢水平与机体机能状态[13-15]，研究神经递质对贝类循环生理的调控作用对分析贝类应对环境胁迫的生理响应有重要意义。目前，关于贝类儿茶酚胺类激素的研究主要集中在环境胁迫下其含量的变化规律[16]，而关于这类神经递质是如何调控贝类循环生理功能的研究却少见报道。

多普勒超声成像技术可清晰呈现生物器官内部的血流方向、速度和血流量等血流动力学指标信息，实现生物血流状态的无损实时监测[17-18]，已应用于双壳贝类研究。Haefner 等[19]应用超声技术研究了不同温度下紫贻贝（Mytilus edulis）心率和血流加速度的变化特征。郝杰华等[18]应用超声技术研究了不同温度下栉孔扇贝（Chlamys farreri）和虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）的心率和血流量等循环生理指标的变化特征。本研究基于多普勒超声成像技术，探究不同浓度儿茶酚胺类激素对华贵栉孔扇贝循环生理功能的调控效应，为贝类循环生理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验扇贝

华贵栉孔扇贝，壳长为（5.66±0.40）cm，体质量（34.79 ± 6.91）g，取自海南省澄迈县新兴港的筏式养殖海区，挑选健康扇贝，清洗，去除壳上附着物，于循环水培养系统中暂养1 周[水温(25±1)℃，盐度31]。暂养期间每天喂食微藻2次，隔天更换水循环系统中1/3的海水。

1.2 化学试剂

将多巴胺（纯度98%，上海麦克林生物科技有限公司）、去甲肾上腺素（纯度99%，美国CATO 公司）和肾上腺素（纯度99.5%，北京曼哈格生物科技有限公司）分别溶于灭菌海水[12]，配置成0.2、1.0、2.0 μmol/L的溶液，于4 ℃下保存备用。

1.3 实验设备

动物全数字彩色多普勒超声诊断系统，FL-60181 型，徐州派尔有限公司，配备一个8～12 MHz的高频防水线性发射探头。扫描模式设置为B模式（黑白），使用探针扫描实验扇贝，调整至屏幕显示清晰的血管图像。随后设置为C 模式（彩色），观测血流动态，最后打开D 模式（多普勒脉冲），在血管中部放置一个0.5 mm 的采样点，以获取心率（HR）、收缩峰值速度（PS）、舒张末期速度（ED）、血流量（FV）等循环生理指标的最活跃血流动态图像（图1）。

图1 扇贝鳃血管的多普勒超声成像（脉冲模式）Fig.1 Doppler ultrasonic imaging(pulse mode)of the scallop branchial vessel

1.4 实验方法

根据周智[12]研究及本研究预实验结果，当激素浓度高于2.0 μmol/L时华贵栉孔扇贝在40 min 左右濒临死亡，无法监测到血流动态，因此，设置0.2、1.0、2.0 μmol/L 三个浓度梯度。采用微量进样器将不同浓度激素从闭壳肌注入体内，注射量为50 μL，对照组注射等量灭菌海水，每组5 个重复。使用多普勒超声系统监测注射后0、5、20、40、60、180、300 min 时各循环生理指标的变化情况。各指标定义：HR，每分钟的心跳数（次）；PS，被测量血管内血液的瞬时峰值速度（mm/s）；ED，被测量血管内血液的最低瞬时速度（mm/s）；FV，被测量血管的横截面上的每分钟血流量（mL/min）。

1.5 数据处理

用相对变化率（R）表示注射不同浓度儿茶酚胺类激素后扇贝各循环生理指标变化趋势，计算公式：

其中，Rt表示t时刻的相对变化率（%），Nt表示各处理组t时刻循环生理指标，N0表示各处理组在0时刻的循环生理指标值。

使用excel 对实验数据进行反正弦转换，采用SPSS 18.0对所得数据进行单因素方差分析，若差异显著，则进行Duncan 多重比较，显著性水平α=0.05。数据以平均值±标准误（Mean±SE）表示。

2 结果

2.1 注射儿茶酚胺类激素后扇贝心率的变化

2.1.1 多巴胺 由表1 可见，0.2 μmol/L 多巴胺处理组扇贝的心率（HR）相对变化率与海水对照组变化趋势一致，均为先上升后下降，在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05），且在各个时间点与海水对照组之间均无显著差异（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组扇贝HR 相对变化率总体上呈先升后降趋势，在60 min时为19.50% ± 10.28%，显著高于初始水平（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组HR 相对变化率总体上有先升后降趋势，在180 min时为18.14% ± 4.51%，显著高于初始水平和对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复 到初始水平（P＞0.05）。

表1 注射不同浓度多巴胺后华贵栉孔扇贝心率相对变化率Table 1 Relative change rate of heat rate in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of dopamine(DA) %

2.1.2 去甲肾上腺素 由表2 可见，0.2 μmol/L 去甲肾上腺素处理组扇贝的HR 相对变化率与海水对照组变化趋势一致，均为先上升后下降，在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05），且在各个时间点与海水对照组之间均无显著差异（P＞0.05）。1.0 μmol/L组HR 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在5 min时有上升趋势，为10.53%±4.01%，但与初始水平和海水对照组均无显著差异（P＞0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组HR 相对变化率总体上呈先下降后上升趋势，在5 min 时为-10.31%±2.11%，显著低于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复 到初始水平（P＞0.05）。

表2 注射不同浓度去甲肾上腺素后华贵栉孔扇贝心率相对变化率Table 2 Relative change rate of HR in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of norepinephrine(NE) %

2.1.3 肾上腺素 由表3 可见，0.2 μmol/L 肾上腺素处理组扇贝的HR 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在40 min时为24.74%±5.59%，显著高于初始水平（P＜0.05），但与海水对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组扇贝的HR 相对变化率变化趋势与0.2 μmol/L 组一致，为先上升后下降，在180 min 时为13.33%±4.42%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组HR 相对变化率总体上呈先下降后上升趋势，在5 min 时为-11.39% ±10.19%，与初始水平相比无显著差异（P＞0.05），但显著低于海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表3 注射不同浓度肾上腺素后华贵栉孔扇贝心率相对变化率Table 3 Relative change rate of HR in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of epinephrine(E) %

2.2 注射儿茶酚胺类激素后扇贝舒张末期速度的变化

2.2.1 多巴胺 由表4 可见，0.2 μmol/L 多巴胺处理组扇贝的舒张末期速度（ED）相对变化率变化趋势与海水对照组一致，均为先上升后下降，在20 min时为57.09%±11.47%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组扇贝ED 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在5 min 时为31.84%±7.85%，但与初始水平和对照组均无显著差异（P＞0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L组ED相对变化率在20 min时有下降趋势，为-11.29%±12.34%，但与初始水平和对照组均无显著差异（P＞0.05），在180 min 时为43.10% ± 11.52%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表4 注射不同浓度多巴胺后华贵栉孔扇贝舒张末期速度相对变化率Table 4 Relative change rate of end-diastolic velocity(ED)in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of DA %

2.2.2 去甲肾上腺素 由表5 可见，0.2 μmol/L 去甲肾上腺素处理组扇贝的ED 相对变化率呈先上升后下降趋势，在5 min 时为66.75% ± 9.52%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组扇贝ED 相对变化率总体上有先上升后下降趋势，在5 min 时为21.34%±10.88%，但与初始水平和海水对照组相比均无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组ED 相对变化率在5 min 时有下降趋势，为-15.39% ± 7.83%，但与初始水平无显著差异（P＞0.05），而显著低于海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表5 注射不同浓度去甲肾上腺素后华贵栉孔扇贝舒张末期速度相对变化率Table 5 Relative change rate of ED in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of NE %

2.2.3 肾上腺素 由表6 可见，0.2 μmol/L 处理组扇贝的ED 相对变化率呈先上升后下降趋势，在40 min 时为66.02%±11.01%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05）。1.0 μmol/L 组扇贝ED 相对变化率的变化趋势与0.2 μmol/L组一致，为上升后下降，180 min 时为44.65% ± 5.99%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组ED 相对变化率在20 min有下降趋势，为-6.83%±10.88%，显著低于海水对照组（P＜0.05），但与初始水平无显著差异（P＞0.05），在60 min时有上升趋势，为20.39%±9.62%，但与初始水平和海水对照组相比均无显著差异（P＞0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表6 注射不同浓度肾上腺素后华贵栉孔扇贝舒张末期速度相对变化率Table 6 Relative change rate of ED in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of E %

2.3 注射儿茶酚胺类激素后扇贝收缩峰值速度的变化

2.3.1 多巴胺 由表7 可见，0.2 μmol/L 多巴胺处理组扇贝的收缩峰值速度（PS）相对变化率与变化趋势海水对照组一致，均为先上升后下降，在20 min时为53.08%±10.51%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组PS 相对变化率总体上呈先上升后下降再上升趋势，5、60 min 时分别为33.00%±5.17%、34.96% ± 13.49%，显著高于初始水平（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组PS 相对变化率在20 min时为-7.00%±13.71%，但与初始水平和海水对照组均无显著差异，在180 min 时为34.80%±11.33%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表7 注射不同浓度多巴胺后华贵栉孔扇贝收缩峰值速度的相对变化率Table 7 Relative change rate of peak systolic velocity(PS)in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of DA %

2.3.2 去甲肾上腺素 由表8 可见，0.2 μmol/L 去甲肾上腺素处理组扇贝的PS 相对变化率呈先上升后下降趋势，在5 mim 时为30.65%±4.98%，显著高于初始水平（P＜0.05），但与海水对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组PS 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在5 min时为26.97%±12.75%，但与初始水平和海水对照组均无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复 到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组PS 相对变化率的变化趋势与海水对照组相反，为先下降后上升，在5 min 时为-27.72%± 5.78%，显著低于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表8 注射不同浓度去甲肾上腺素后华贵栉孔扇贝收缩峰值速度的相对变化率Table 8 Relative change rate of PS in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of NE %

2.3.3 肾上腺素 由表9 可见，0.2 μmol/L 肾上腺素处理组扇贝的PS相对变化率呈先上升后下降趋势，在40 min 时为49.23% ± 5.95%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组PS 相对变化率变化趋势与0.2 μmol/L 组一致，为先上升后下降趋势，180 min时为37.42%±5.42%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。而2.0 μmol/L 组PS 相对变化率总体上呈先下降后上升再下降趋势，在5 min 时为17.19%±5.62%，显著低于海水对照组（P＜0.05），但与初始水平无显著差异（P＞0.05），在180 min 时为19.38±7.05%，显著高于海水对照组（P＜0.05），但与初始水平无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表9 注射不同浓度肾上腺素后华贵栉孔扇贝收缩峰值速度的相对变化率Table 9 Relative change rate of PS in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of E %

2.4 注射儿茶酚胺类激素后扇贝血流量的变化

2.4.1 多巴胺 由表10可见，0.2 μmol/L多巴胺处理组扇贝的血流量（FV）相对变化率变化趋势与海水对照组一致，均为先上升后下降，在20 min 时为46.27%±7.06%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组FV 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在5 min 时为30.86% ± 7.76%，显著高于初始水平水平（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组FV 相对变化率在180 min 时为33.81% ± 8.98%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复 到初始水平（P＞0.05）。

表10 注射不同浓度多巴胺后华贵栉孔扇贝的血流量相对变化率Table 10 Relative change rate of blood flow volume(FV)in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of DA %

2.4.2 去甲肾上腺素 由表11可见，0.2 μmol/L去甲肾上腺素处理组扇贝的FV 相对变化率呈先上升后下降趋势，在5 min 时为33.68% ± 4.04%，显著高于初始水平（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组FV 相对变化率总体上呈先上升后下降趋势，在5 min为26.40%±13.30%，但与初始水平和海水对照组均无显著差异（P＞0.05）。2.0 μmol/L处理组扇贝的FV 相对变化率总体上呈先下降后上升趋势，在5 min时为-21.31%±6.65%，显著低于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 恢复到初始水平。

表11 注射不同浓度的去甲肾上腺素后华贵栉孔扇贝的血流量相对变化率Table 11 Relative change rate of FV in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of NE %

2.4.3 肾上腺素 由表12可见，0.2 μmol/L肾上腺素处理组扇贝的FV 相对变化率呈先上升后下降趋势，在40 min时为57.91%±9.19%，显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。1.0 μmol/L 组FV 相对变化率变化趋势与0.2 μmol/L 组一致，为先上升后下降，在60、180 min 时分别 为36.45%±13.03%、37.55% ±5.76%，均显著高于初始水平和海水对照组（P＜0.05），在300 min 时恢复到初始水平（P＞0.05）。2.0 μmol/L 组FV 相对变 化率在5 min 时有下降趋势，为-13.83% ± 6.64%，与初始水平无显著差异（P＞0.05），但显著低于海水对照组（P＜0.05），在180 min 时为22.69% ± 7.87 %，与初始水平无显著差异（P＞0.05），但显著高于海水对照组（P＜0.05），在300 min时恢复到初始水平（P＞0.05）。

表12 注射不同浓度的肾上腺素后华贵栉孔扇贝的血流量相对变化率Table 12 Relative change rate of FV in Chlamys nobilis after injection of different concentrations of E %

3 讨论

儿茶酚胺作为神经内分泌系统的关键信号分子，与生物体内稳态的维持息息相关[20-21]。当贝类受胁迫后，其促肾上腺皮质激素释放激素-促肾上腺皮质激素-生物胺轴分泌儿茶酚胺、神经肽和促肾上腺皮质激素等，这些信号物质会对贝类的循环系统产生兴奋或抑制效应[22-23]。本研究应用多普勒超声成像技术，分析不同浓度的儿茶酚胺类激素对华贵栉孔扇贝循环生理指标的影响，涉及循环生理指标包括HR、ED、PS和FV等。

3.1 儿茶酚胺类激素对扇贝HR的影响

心率或心脏活动可作为贝类生理反应的指标[24-26]，HR 由对贝类有抑制或兴奋作用的化学递质所介导[27]。多巴胺为内源性儿茶酚胺，对生物HR有调控作用，但浓度不同，对生物HR 的影响也不尽相同，往往表现出一定的剂量效应关系[28-29]。一定剂量下，多巴胺可抑制HR[30]。注射75 μg/g 的多巴胺可使翡翠贻贝（Perna viridis）的HR 降低[31]。本研究中，注射低浓度（0.2 μmol/L）多巴胺后，扇贝HR相对变化率在各时间点与海水对照组之间无显著差异；浓度为1.0 μmol/L 时，扇贝的HR 相对变化率在5 min 时为12.17% ± 3.32%，仅为对照组的58%左右，在20 min 时下降至-2.64%±4.33%，此时海水对照组的HR 相对变化率为10.45% ± 6.49%；浓度为2.0 μmol/L 时，扇贝HR 相对变化率在0～20 min内呈下降趋势，显著低于海水对照组，表明低浓度多巴胺对扇贝心率影响不大，而当浓度达到1.0 μmol/L 及以上时，扇贝HR 受到抑制，且浓度越高抑制效果越明显。此外，本研究还发现，中高浓度去甲肾上腺素和肾上腺素激素也具有抑制扇贝HR的效应。

当双壳类动物完全浸入水中时，除了闭壳或关闭虹吸管时心率会波动外，心率均处于稳定状态[32]。本研究发现，正常状态下华贵栉孔扇贝的心率保持在（26.0±1.5）次。郝杰华等[10]在研究栉孔扇贝循环生理特征中发现，正常状态下HR在16次左右，该差异可能是由种间差异及适宜水温不同所致。

3.2 儿茶酚胺类激素对扇贝ED和PS的影响

舒张末期速度和收缩峰值速度是指心动周期中最慢和最快血流速度，标志着一个心动周期的速度极限，可反映心脏容量、泵血能力和效率。与PS相比，ED对血流动力学变化更为敏感，但PS受多普勒伪像的影响较小，更适合于动态血流调节控制系统的分析[33]。在医学上PS 被用来判定肾动脉是否受损[34]。Hao 等[35]发现，在缺氧胁迫下华贵栉孔扇贝PS波动较大，而ED受影响较小。本研究发现，注射2.0 μmol/L 去甲肾上腺素后，扇贝PS 较ED 也呈现出更大波动。此外，注射高浓度（2.0 μmol/L）的儿茶酚胺类激素后，扇贝PS相对变化率在前40 min显著降低，其中去甲肾上腺素处理组扇贝PS降幅最大，多巴胺处理组扇贝PS 降幅最小，表明该时间段内扇贝心脏的泵血功能受到抑制，而抑制程度由大到小依次为去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺。

3.3 儿茶酚胺类激素对扇贝FV的影响

血液是营养物质和氧气的载体，生物各组织器官氧气调控依赖于血流的调节[36]。本研究中，低浓度（0.2 μmol/L）的多巴胺和肾上腺素刺激会使扇贝鳃血管的血流量显著增加，以助于获得更多的氧气来应对外界胁迫。然而，当注射激素浓度达到2.0 μmol/L 时，扇贝FV 相对变化率在0～40 min 内总体上为负值，且在注射后5 min 显著低于海水对照组。表明高浓度的儿茶酚胺类激素对扇贝的循环系统造成较大负担。在注射激素浓度同为2.0 μmol/L 的情况下，华贵栉孔扇贝FV 降幅不同，这可能由不同激素刺激后导致的血管收缩程度不同所引起。

本研究发现，血流动态的变化与心率间不尽相似，低浓度（0.2 μmol/L）的多巴胺对扇贝HR 影响不大，但使ED、PS、FV 在20 min 时显著增加。Nicholson[37]的研究中也有类似报道，缺氧条件下翡翠贻贝（Perna viridis）HR 显著降低，但FV 增加以维持正常的血淋巴循环，这可能和心室的每搏输出量增大有关。因此，需要增加相应心脏动力学指标以深入解释其调控机制。

3.4 儿茶酚胺类激素浓度对扇贝循环生理功能的影响

本研究发现，不同浓度儿茶酚胺类激素对扇贝循环生理功能的调控会随着时间而发生变化。以多巴胺为例，1.0 μmol/L和2.0 μmol/L的多巴胺在前期使扇贝的循环生理功能受到抑制，而在中后期使其兴奋，在300 min 时扇贝循环生理功能恢复到正常水平。推测可能是激素在扇贝体内通过代谢功能逐渐转化为其他代谢产物，其含量降低而造成了这一现象。如多巴胺可在生物体内可被代谢为3,4-二羟苯乙酸和高香草酸[38]，进而导致体内被注射的多巴胺含量降低。

4 结论

本研究以华贵栉孔扇贝为研究对象，探究儿茶酚胺类激素对其循环生理的影响。结果发现，低浓度（0.2 μmol/L）的儿茶酚胺类激素对扇贝的部分循环生理指标起兴奋作用，中高浓度（1.0、2.0 μmol/L）的儿茶酚胺类激素对扇贝的循环生理功能起先抑制后兴奋作用。本研究可为贝类神经内分泌系统对循环生理功能调控研究提供参考。