赵汝娜

德州市城市园林规划设计研究院，山东 德州 253000

0 引言

白皮松（Pinus bungeanaZucc. ex Endl.）是我国特有针叶树种，树姿优美挺拔，树皮特点鲜明，极具观赏价值[1］。白皮松木材可用于房屋建筑、家具制造等，且种子可食。白皮松果实具有镇咳、祛痰、平喘等功效。另外，白皮松在吸收粉尘、二氧化硫等有害气体方面有着得天独厚的优势。白皮松用途广泛，因而深受林业相关人员青睐，但如何提高白皮松引种成活率及抗逆性有待加强研究。

外生菌根菌是一类可以与特定植物根系形成菌根的高等真菌。菌根可以扩大寄主植物根系吸收养分与水分的范围，促进营养元素吸收；能够产生刺激植物生长的物质；还能够对特定致病菌产生拮抗作用，提高植物抗病性。在生产实践中，接种外生菌根真菌，对提高苗木成活率及抗逆性效果显著。金陈斌[2］研究表明，对白皮松、桧柏等松柏类古树接种外生菌根菌后，其根系活力增强，生长量明显提升，衰老趋势得以延缓。此外，接种外生菌根菌可以促进马尾松、樟子松幼苗对养分的吸收与积累，有利于幼苗生长[3-4］。接种外生菌根菌可以提高黑松等对逆境的抗性，缓解干旱、土壤酸化及盐渍化等逆境胁迫[5-7］。外生菌根菌在松树育苗和造林中的应用结果表明，接种外生菌根菌可以提高出苗率，促进苗木生长，而且明显提高造林成活率[8-9］。

厚环乳牛肝菌[Suillus grevillei（Kl.）Sing.］，又名厚环粘盖牛肝菌、雅致乳牛肝菌，是一种外生菌根真菌[9-10］，也可食用。笔者对厚环乳牛肝菌培养条件进行一系列优化筛选，并将其接种于白皮松盆栽苗，研究其对白皮松生长及土壤碱化的影响，探索以外生菌根菌接种提高白皮松成活率、促进白皮松生长的有效途径，以期为提高白皮松引种成功率提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

厚环乳牛肝菌购自中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，白皮松盆栽苗系实验室栽培。

1.2 培养基

1.2.1 固体培养基。培养基A（常规PDA 培养基）的配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL；培养基B 的配方为马铃薯葡萄糖琼脂粉①40.1 g、水1 000 mL；培养基C 的配方为马铃薯葡萄糖琼脂粉②37.0 g、水1 000 mL；培养基D 的配方为马铃薯葡萄糖琼脂粉③40.1 g、水1 000 mL；培养基E 的配方为麦芽浸膏5.0 g、葡萄糖5.0 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5 g、硫酸镁（MgSO4）0.5 g、氯化铵（NH4Cl）0.5 g，氯化铁（FeCl3）1.0%溶液10 滴、琼脂15 g 和水1 000 mL；培养基F 的配方为麦芽糖2.0 g、葡 萄 糖2.0 g、可 溶 性 淀 粉2.0 g、硫 酸 镁（MgSO4）0.5 g、氯化钙（CaCl2）0.5 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.25 g、琼脂20 g 和水1 000 mL。以上6种培养基在121 ℃条件下灭菌20 min 后制成平板备用。

1.2.2 液体培养基。液体培养基配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，121 ℃条件下灭菌20 min 后备用。

1.3 试验方法

1.3.1 厚环乳牛肝菌培养条件优化筛选。①固体培养基筛选。将菌种接种于1.2.1所述6种固体培养基上，于20 ℃条件下培养。②培养温度筛选。将菌种接种在常规PDA培养基上，分别在15.0、17.5、20.0、22.5 ℃及25.0 ℃条件下培养。③培养基pH值筛选。用稀盐酸溶液或稀氢氧化钠溶液将常规PDA 培养基pH 值调节为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0，接种菌种后在20 ℃条件下培养。④光照条件筛选。将菌种接种在常规PDA培养基上，分别置于室内自然光及黑暗条件下，在20 ℃条件下培养。⑤湿度条件筛选。将菌种接种在常规PDA培养基上，一组使用封口膜封口进行保湿，一组不进行封口，在20 ℃条件下培养。⑥接种方向筛选。将菌种接种在常规PDA 培养基上，一组菌丝块正面向上，一组菌丝块正面向下，在20 ℃条件下培养。上述试验均取直径6 mm菌丝块接种于培养基上，每个处理3个重复，在相应条件下置于生化培养箱中恒温培养14 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.2 接种厚环乳牛肝菌于白皮松试验。将菌丝块捣碎接种于1.2.2所述液体培养基中，在20 ℃条件下振荡培养24 d，过滤，弃去滤液，菌丝进行匀浆。匀浆后将菌液用灌根法接种于白皮松盆栽苗，对照组白皮松使用等量清水进行相同操作。接种组和对照组各10个重复，试验期间（2022 年1—4 月）正常养护，灌溉用水pH值为8.15。接种前及接种3个月后分别测量白皮松高度、地径及土壤pH值。株高测定方法为用直尺测量株高（含盆），测量3次取平均值；地径测定方法为用游标卡尺测量距盆土表面10 cm处树干直径，测一组垂直交叉数据，取平均值；土壤pH值采用电位法测定。

1.4 试验数据分析

采用Excel 软件进行数据统计，应用SPSS 进行差异性分析。

2 试验结果与分析

2.1 培养条件筛选结果分析

2.1.1 培养基。培养基是菌丝生长的物质基础，其组成成分尤为重要。菌丝在不同培养基上的生长速度和菌落形态存在差异。由表1 可知，培养基A 和培养基F 上的菌落直径较大，分别为13.05 mm 和11.30 mm。其中，培养基A 上的菌落表现为菌丝洁白、长势致密，培养基F 上的菌落菌丝长势稀疏。培养基E 上的菌落直径稍小，为8.87 mm，培养基B、培养基C、培养基D 上的菌落几乎未见生长。综上所述，在6 种供试培养基中，培养基A 最适宜厚环乳牛肝菌菌丝生长，表现为生长速度快且菌丝洁白致密。

表1 厚环乳牛肝菌在不同配方培养基上的生长情况

2.1.2 温度。厚环乳牛肝菌菌丝在2～35 ℃条件下均可生长[10-11］。如表2 所示，培养温度在15.0～25.0 ℃时，菌落直径为11.25～14.75 mm，并且随温度升高呈先增加后减小趋势，适宜菌丝生长的温度为20.0～25.0 ℃，最适宜温度为22.5 ℃。

表2 温度对厚环乳牛肝菌菌丝生长的影响

2.1.3 pH 值。培养基pH 值对菌丝生长具有重要影响，适宜的pH值有利于菌丝生长。如表3所示，培养基pH 值为4.0～8.0 时，菌落直径为14.08～15.93 mm，并且随pH 值升高呈现先增加后减小趋势。培养基pH值为5.0～7.0 时，菌丝生长速度较快，其中pH 值为6.0时菌落直径最大、长势最好。

表3 培养基pH值对厚环乳牛肝菌菌丝生长的影响

2.1.4 光照。试验结果表明，黑暗条件下培养的菌落直径为14.73 mm，光照条件下培养的菌落直径为12.56 mm，黑暗组菌落直径比光照组大17.3%。此外，黑暗组菌丝更为洁白，且直立生长趋势明显，次生代谢物明显减少。

2.1.5 湿度。试验结果表明，封口组菌落直径为13.40 mm，未封口组菌落直径为11.02 mm，封口组菌落直径比未封口组大22%。由此可见，保持一定的湿度可以明显促进菌丝生长。

2.1.6 接种方向。试验结果表明，菌丝块正面向下组菌落直径为18.15 mm，向上组菌落直径为14.29 mm，向下组菌落直径比向上组大27%。由此可见，菌丝块菌丝面接触培养基的接种方法明显有利于菌丝生长。

2.2 接种厚环乳牛肝菌于白皮松结果分析

2.2.1 白皮松株高和地径。接种组白皮松株高生长量是对照组的2.7倍，地径生长量是对照组的1.4倍。由此可见，接种厚环乳牛肝菌对白皮松生长具有明显的促进作用（见表4）。

表4 接种厚环乳牛肝菌对白皮松株高和地径的影响

2.2.2 土壤pH 值。由表5 可知，接种组和对照组土壤pH 值均有不同程度的升高，接种组pH 值升高0.27，对照组pH 值升高0.21。由此表明，接种厚环乳牛肝菌对抑制土壤碱化效果不明显。

表5 接种厚环乳牛肝菌对土壤pH值的影响

3 讨论

该研究探索了培养基配方、温度、pH 值、光照、湿度和接种方向等因素对厚环乳牛肝菌菌丝生长的影响。其中，培养基配方对厚环乳牛肝菌菌丝的生长影响极大，具体表现在菌丝生长速度、菌落形态及次生代谢物等方面。在该研究筛选的6 种固体培养基中，常规PDA 培养基最适宜厚环乳牛肝菌菌丝生长，菌丝生长速度最快、菌落洁白致密、次生代谢物相对较少。适宜厚环乳牛肝菌菌丝生长的温度为20～25 ℃，与前人研究结果（15～20 ℃）[11］略有差异，表明不同菌株的生长适温可能存在差异。最适宜厚环乳牛肝菌菌丝生长的pH值为5.0～7.0，与前人研究结果一致[11-12］，且培养基pH 值为6.0 时厚环乳牛肝菌菌丝生长速度最快。PDA 培养基的自然pH 值与此相近，因此，配制培养基时可视情况省略调节pH 值这一操作。光照可以促进厚环乳牛肝菌子实体分化，使其长势健旺、颜色纯正[11］，但同时会抑制其菌丝生长，并促进次生代谢物合成，延长培养周期。水分是菌丝生长的基础。厚环乳牛肝菌培养周期较长，在利用固体培养基培养时宜对其用封口膜封口，以防止水分散失，进而促使菌丝正常生长。对于厚环乳牛肝菌菌丝块的接种方向鲜有学者提及，此研究发现接种块向下接种、使菌丝接触培养基有利于菌丝生长。

外生菌根菌是森林生态系统的重要组分，其对寄主植物的生长、抗病性、抗逆性等方面均有极大的影响。周文婷[13］研究表明，对湿地松接种厚环乳牛肝菌能够增加湿地松针叶中叶绿素的含量，促进湿地松对土壤中氮和磷元素的吸收，从而促进其生长。尹大川等[14］研究表明，对樟子松接种厚环乳牛肝菌等外生菌根菌能够增加樟子松针叶中光合色素的含量，并且提高苗木自身及根际土壤相关酶类的活性，从而促进苗木生长，诱导苗木产生对氧化胁迫的抗性。郭秀珍等[15］研究表明，接种厚环乳牛肝菌对油松幼苗猝倒病具有防治作用，厚环乳牛肝菌菌丝对立枯丝核菌及尖孢镰刀菌等致病菌具有拮抗作用。温祝桂等[7］研究表明，接种外生菌根菌可以提高黑松体内脯氨酸含量，促进黑松对K+的吸收和转运，从而提高黑松对盐碱化土壤的适应性。白皮松喜酸性土壤，不耐盐碱[16］。笔者所在地区土壤偏碱性，土壤pH值普遍在8.0以上，对白皮松引种成活率造成了不利影响。该研究对白皮松盆栽苗接种厚环乳牛肝菌，结果表明厚环乳牛肝菌对白皮松生长有促进作用，接种后白皮松的株高和地径生长量均明显提升；但是，接种厚环乳牛肝菌对抑制土壤pH 值升高未见明显效果，甚至接种组土壤pH 值略高于对照组，而接种组白皮松株高和地径生长量仍然明显高于对照组。这一结果表明，接种厚环乳牛肝菌可能会增强白皮松对碱化土壤的耐受性。厚环乳牛肝菌促进白皮松生长的作用机制及该菌种对白皮松耐盐碱、抗病性等方面的影响有待继续研究。另外，该研究采用灌根法对白皮松进行厚环乳牛肝菌接种，操作简单便捷，其他接种方法如截根法、沟施法等[17］的接种效率仍有待进一步探索。同时，厚环乳牛肝菌对白皮松地栽苗的生长是否同样具有促进作用也需要探究，从而为厚环乳牛肝菌在白皮松引种栽培中的应用提供更为全面、科学的依据。

4 结论

此研究较为细致地探讨了厚环乳牛肝菌菌丝的培养条件，确定其适宜培养条件为常规PDA 培养基、温度20～25 ℃、pH 值5.0～7.0、黑暗条件、较高湿度、菌丝块向下接种，为实验室快速培养厚环乳牛肝菌菌丝提供了重要参考依据。此研究结果表明，在白皮松根部接种厚环乳牛肝菌，白皮松株高和地径等生长指标明显提升，即接种厚环乳牛肝菌对白皮松生长具有促进作用。此研究为外生菌根菌在白皮松上的应用提供了理论依据，对提高白皮松在各地尤其是盐碱地区的引种成功率具有借鉴意义。