许志勇，李 雯，姜本政，信淑珍，朱 雯

（1.黑龙江省宝清县农业农村局，黑龙江 宝清 155600；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

维生素A（视黄醇）对于机体多种生理过程至关重要，包括视力、免疫功能、生殖、胚胎发育以及细胞生长和分化［1］。视黄醇代表牛血中最丰富的类视黄醇［2］，即使给动物喂食不含维生素A 的饲料，其在公牛机体中的水平也至少可以维持145 d［3］。母牛和奶牛的血清视黄醇和β-胡萝卜素水平在妊娠结束时下降，分娩时达到最低值，并在哺乳的第1 周再次增加［4］。血清视黄醇浓度的降低可能是由于大量视黄醇及其衍生物转移到初乳中，导致类视黄醇在初乳中激增。

类视黄醇是分子量小的疏水性化合物，因此需要与可溶性蛋白质结合。视黄醇结合蛋白4（RBP4）是负责血浆视黄醇转运的蛋白，并以1∶1 的比例与视黄醇结合。据报道RBP4 在小鼠中诱导胰岛素抵抗［5］，并且人类血清RBP4 水平与葡萄糖耐量降低或2 型糖尿病患者的胰岛素抵抗程度相关。STRA6 被鉴定为RBP4 的细胞表面受体［6］，表明RBP4 是一种新型的生物活性因子。但RBP4 在反刍动物机体内调节情况尚不明确，尤其是在奶牛初乳中是否存在RBP4，其调控方式是否与类视黄醇相似不明确。本试验检测了围产期奶牛血清、初乳和常乳中RBP4和视黄醇浓度以及血清中INS 含量，以评估反刍动物血浆RBP4 和视黄醇水平的调节。

1 材料与方法

1.1 血清、初乳及常乳的收集

在黑龙江省某集约化牛场随机选取体重450～550 kg 的未怀孕、未哺乳的荷斯坦奶牛（n=30），检查未进食前血清RBP4、视黄醇和INS 水平。清晨未进食前从颈静脉收集血液，离心（1500 r∕min）收集上清液后再离心（12000 r∕min）分离血清，并于-30 ℃保存。在同一牛场随机选取怀孕的荷斯坦奶牛（n=30）。产犊前3～6 d，分娩当天以及产犊后7 d 和14 d 收集血清和乳清样品。离心后-30 ℃保存。

1.2 血清和乳清中RBP4 的蛋白质印迹分析

参考文献［7］纯化牛RBP4，将纯化的RBP4 免疫获得血清抗体。血清用蒸馏水稀释20 倍，乳清用蒸馏水稀释10 倍。通过常规SDS-PAGE 电泳试验（13%的浓缩胶）同时分离血清（7.5 mL）、乳清（24 mL）及纯化后的RBP4。将蛋白质电印迹转移到PVDF 膜（ImmobilonTM，Millipore，Bedford MA，USA）上。将膜在5%（W∕V）脱脂乳中封闭1 h，然后与抗RBP4 血清（1∶2000）在缓冲液中孵育48 ℃。用洗涤缓冲液洗涤5 次，并与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 兔IgG 抗 体（1∶4000，Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco CA，USA）在室温下孵育1 h。使用Image 程序以光密度法分析免疫反应条带的表达强度。通过比较条带灰度与纯化的RBP4 强度来测量RBP4 浓度。

1.3 分光光度法测定血清和乳清中的视黄醇

通过文献［8］描述的方法测定血清，将50 mL 乙醇和150 mL 己烷加入50 mL 血清和乳清中，混合40 min，并在12000 r∕min 离心10 min 后回收己烷。基于己烷提取物在325 nm 和453 nm 处的吸光度计算视黄醇浓度。

1.4 血清中INS 的检测

利用商用INS 的ELISA 试剂盒（上海酶免公司）检测试验奶牛血清中INS 含量，根据说明书操作。

1.5 统计分析

结果表示为“平均值± 标准差（SEM）”。双向重复测量ANOVA，其中P＜0.05 被认为差异显著。利用SPSS 23.0 软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 RBP4 蛋白纯化表达情况

如图1 所示，纯化的牛RBP4 条带强度与蛋白质量密切相关，将10～80 ng 的RBP4 添加到牛血清和乳清后，纯化的RBP4 分别以（96.2 ± 0.4）%和（95.4± 0.8）%回收。组间和组内差异小于5.1%和2.4%，表明纯化的牛RBP4 可以用于后续试验。

图1 Western blot 对RBP4 的定量分析

2.2 分娩前后血清RBP4 和视黄醇水平变化

分娩前3～6 d血清RBP4水平为（50.7±5.3）μg∕mL，与对照组相比无显著差异。分娩当天，RBP4 浓度显著下降［（29.8±5.4）μg∕mL］，但分娩后14 d 恢复到产前水平［（52.1±2.1）μg∕mL］（图2A）。分娩前血清视黄醇水平为（26.6±3.3）μg∕dL，与对照组相当。与RBP4 相似，分娩当天视黄醇水平显著降低［（18.5±2.7）μg∕dL］，分娩后15 d［（33.9±4.3）μg∕dL］恢复到基础水平（图2B）。分娩前后的视黄醇∕RBP4 比值无显著差异（图2C）。

图2 分娩前后奶牛血浆RBP4 和视黄醇水平的变化

2.3 分娩前后乳清中RBP4 和视黄醇水平的变化

在分娩前3～6 d 乳清中未检测到RBP4 表达。在初乳中，RBP4 浓度为（16.4±5.6）μg∕mL（图3A）。分娩后第7 天和第15 天，RBP4 从乳清中消失。乳清中视黄醇浓度［（分娩后7 d 为（43.5±6.9）μg∕dL］与血清视黄醇浓度相当，但初乳中的视黄醇浓度显著升高［（295.3±5.9）μg∕dL］。初乳中视黄醇与RBP4的摩尔比为20∶1。

2.4 血清中INS表达情况及其与RBP4相关性分析

分娩前3～6 d血清INS水平为（0.32±0.01）ng∕mL，与对照组相比，无显著差异。分娩当天，INS 浓度开始显著下降［（0.27±0.02）ng∕mL］（表1）。产后14 d，INS 浓度为（0.34±0.01）ng∕mL，分娩当天INS 浓度与RBP4 水平呈正相关（R=0.84）。

表1 奶牛血清中INS 浓度

3 结论与讨论

试验首次证明了初乳中存在大量RBP4，但常乳中却很少。初乳中RBP4 水平的增加伴随着产犊当天血浆RBP4 的相应降低。由于RBP4 在常乳中几乎不存在，因此RBP4 不太可能在乳腺中合成。RBP4 最有可能从血液转移到初乳，导致血浆水平降低。在乳清中，乳球蛋白是视黄醇的载体，由于一分子RBP4 与一分子视黄醇结合［9］，初乳中视黄醇的存在比RBP4 浓度高近20 倍，表明乳球蛋白是初乳和牛奶中的主要视黄醇载体。尚不清楚初乳RBP4 作为视黄醇载体的生理相关性，但如啮齿动物中所述，RBP4 作为代谢调节剂有助于小牛发育是合理的［5］。

Nonnecke 等［10］研究显示，用不同量的维生素A饲喂犊牛，血浆视黄醇和RBP4 水平呈正相关。机体循环中视黄醇与RBP4 之间的相似关系在儿童和婴儿中证实了［11］，提示RBP4 是视黄醇的替代标志物。在奶牛初乳中发现了大量的RBP4，同时血浆RBP4 下降，表明RBP4 是从血液转运到初乳的。RBP4 和视黄醇水平在生理和病理生理条件下是独立调节的。

人类医学研究发现，RBP4 与多种代谢疾病的产生有密切关系，如常见的肥胖症、糖尿病等，人体和啮齿类动物体内的RBP4 主要通过激活机体的炎症反应来抑制胰岛素的抵抗［12］。本试验结果表明，试验奶牛血清中INS 与RBP4 呈正相关，表明在奶牛产后体内胰岛素代谢与RBP4 密切相关，但其调控机制需要进一步研究。