曾 烨，马 庆，孙楷填，黄志标，张洪胜，谢文波，韩正洲

（1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.广东药科大学，广东 云浮 527300）

三叉苦为芸香科植物三桠苦［Evodia lepta（Spreng.）Merr.］的干燥茎及带叶嫩枝。将三叉苦全年采收，洗净，趁鲜切成段或片，干燥，具有清热解毒、行气止痛、燥湿止痒等功效，可用于治疗高热不退、咽喉肿痛、热毒疮肿、风湿痹痛、湿火骨痛、胃脘痛、跌打肿痛等，外用治疗皮肤湿热疮疹、皮肤瘙痒、痔疮等［1］。

三叉苦为中成药999 感冒灵颗粒、三九胃泰主要原料药材之一，其因清热解毒功效具有广泛的应用基础，年使用量约2 万t。三叉苦野生资源主要分布在中国广东、广西、海南、福建、贵州、台湾及云南南部等地区。三叉苦主要依靠野生资源，而其需求量逐年增加，野生资源又逐渐锐减，供需矛盾日益凸显。为解决野生资源匮乏的问题，广东省、广西壮族自治区等地开展了数万亩的三叉苦产业化种植，其种植技术逐渐规范化。为了确保优良种子繁育和药材质量的稳定，本研究开展了不同生长年限三叉苦的种子和药材质量研究，以期为后续三叉苦种子种苗繁育、规范化和生态种植、科研及流通中的质量控制提供科学参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

不同生长年限的三叉苦种子和药材均由华润三九医药股份有限公司产业化种植基地提供，经广州中医药大学中药学院院长詹若挺鉴定为芸香科植物三桠苦的三叉苦种子和药材。三叉苦对照药材来自中国食品药品检定研究院（批号121682-201301）。

1.2 试剂

甲醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；去离子水（广州屈臣氏有限公司）；95%乙醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；TTC（青岛捷世康科技有限公司）；环己烷（分析纯，东莞市乔科化学有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，西安天茂化工有限公司）。

1.3 测定方法

1.3.1 千粒重 随机取2 份三叉苦，每份1000 粒，放在天平上称重，精确到0.1 g，2 份试样平均值的误差允许范围为5%，不超过5%的则取平均值为该样品的千粒重，超过5%的则再数第3 份试样称重，取平均值作为该样品千粒重。

1.3.2 种子活力 采用TTC 法测定种子活力，每个批次随机数取100 粒净度分析后充分混合净种子，3 次重复。用去离子水浸泡4 h 以上，将泡好的种子用手术刀均匀切成两瓣，选留其中较完整的一瓣（有胚）放入培养皿中，将配置好的1%TTC 溶液倒入培养皿内，轻轻摇动几下，使种子浸入药液里。浸药后，保持在30 ℃恒温箱中，3 h 后观察染色情况，充分着色后，倒出药液，用清水冲洗种子，然后把种子放在吸湿纸上，立即检查。着色为有活力种子，不着色为无活力种子。根据着色数计算百分率，取2 组平均值，代表所测种子活力。计算公式为种子活力=A∕100×100%（A为被染色的种子数，2 次重复间最大容许差距不得超过5%，若超过则再分析第3 次重复，直至达到要求，取差值小的2 次计算测定结果，平均百分率取整数）。

1.3.3 种子发芽率 种子经表面消毒后，随机取100 粒种子均匀置于已经消毒的垫有滤纸的培养皿中，于25 ℃恒温光照培养箱中培养，播种的第5 天记录种子发芽数，第7 天计算发芽指数，第12 天发芽结束计算发芽率，计算公式如下。

1.3.4 鲜重、干重 在基地随机收集5 株长势一致的三叉苦植株，用自来水清洗干净后切片晾干，测定植株鲜重，然后置入牛皮纸袋放入烘箱中，先在105 ℃烘30 min，再在60 ℃下烘至恒重，取出冷却30 min 后称干重。

1.3.5 浸出物 精密称量供试品2～4 g，置于250 mL锥形瓶中，精密加稀乙醇（取95%乙醇529 mL 用水稀释到1000 mL）至50 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放置冷却后取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器过滤，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中，计算供试品中水溶性浸出物的含量（%）［2，3］。

1.3.6 总灰分 将三叉苦药材样品粉碎，过二号筛，混合均匀后，取三叉苦药材样品3～5 g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量（精确至0.01 g），缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重，根据残渣重量计算三叉苦药材中总灰分的含量（%）［2，3］。

1.3.7 薄层鉴别 取样品粉末1 g ，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取三叉苦对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版通则0502）试验，吸取上述2 种溶液各2～5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-乙醇-三乙胺（7∶4∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 16.0 统计软件进行数据分析，数据先进行方差齐性检验，再进行单因素方差分析，方差齐性检验则采用LDS 法。

2 结果与分析

2.1 不同生长年限三叉苦种子质量指标比较

从表1 可以看出，不同生长年限的三叉苦雌株所结种子的千粒重和空壳率没有显著差异，而其种子活力和发芽率有显著差异，随着生长年限的增加，其种子活力和发芽率有显著增加。当三叉苦植株生长到三年生时，其种子活力和发芽率均达到最高，分别为80%和25%，说明三叉苦植株在生长到3年时，其雌雄株达到成熟状态。随着生长年限的继续增加，其种子活力和发芽率的差异均不显著。建议在种植3年以上种源基地开始采收三叉苦种子，其种子活力和发芽率较高。

表1 不同生长年限三叉苦种子质量指标比较

2.2 不同生长年限三叉苦药材生长指标比较

从表2 可以看出，三叉苦植株随着生长年限的增加，其生长指标如株高、近地面直径、主茎干重均呈不断增加的趋势；三叉苦植株从三年生到四年生的过程中生长最为旺盛；从四年生到五年生的过程中生长开始减慢；五年生时主茎干重达最大值，为5.75 kg∕株；随机采集的野生三叉苦植株主茎干重为4.55 kg∕株，低于产业化基地规范化种植的产量。

表2 不同生长年限三叉苦植株生长指标比较

2.3 不同生长年限三叉苦药材理化指标比较

从表3 可以看出，不同生长年限三叉苦药材和野生三叉苦药材浸出物含量、总灰分含量均符合《广东省中药材标准第三册（2019年版）》中三叉苦项规定的标准（浸出物≥4%，总灰分＜5.0%），其浸出物含量明显高于广东省药典标准；不同生长年限三叉苦药材浸出物含量随着生长年限的增加而有一定的减少，二年生三叉苦药材浸出物含量最高，为10.94%，五年生三叉苦药材浸出物含量最低，为6.67%；野生三叉苦植株浸出物含量低于不同生长年限的三叉苦药材，为6.25%。不同批次药材的总灰分和初加工工艺有一定的关系。自建基地生产的药材严格按照初加工方法进行烘干，其总灰分均在2.0%以下。野生药材一般是切片后直接晾晒，其总灰分偏高，为2.5%。

表3 不同生长年限三叉苦浸出物和总灰分含量比较

2.4 不同生长年限三叉苦药材的薄层鉴别

从图1 可以看出，不同生长年限的三叉苦药材和野生三叉苦药材薄层鉴别均符合《广东省中药材标准第三册（2019年版）》中三叉苦项规定的薄层鉴别标准，在与对照药材色谱相应的位置上，均显示相同颜色的荧光斑点。说明不同生长年限的三叉苦药材和野生三叉苦药材的质量均为合格。但是结合表2和表3 的数据，三叉苦生长到三年生以上后，其产量和质量均较高，所以建议产业化推广种植3年后采收。

图1 不同生长年限三叉苦药材的薄层鉴别

3 小结与讨论

三叉苦为雌雄异株的芸香科植物，不同生长年限的三叉苦种子活力和发芽率有显著差异，随着生长年限的增加，其种子活力和发芽率有显著增加。当三叉苦植株长到三年生时，其种子活力和发芽率均达到最高，建议在种植3年以上种源基地开始采收。

不同生长年限的三叉苦药材和野生三叉苦药材浸出物含量、总灰分、薄层鉴别等指标均符合《广东省中药材标准第三册（2019年版）》中三叉苦项规定标准。但是在产业化推广种植过程中，需要结合药材的产量和质量均达到最大化。结合本试验的研究结果，三叉苦到3年生以上后，其产量和质量均较高。同时产业化推广种植三年生以上的三叉苦可以达到野生三叉苦的产量，且质量更优于野生资源，所以建议产业化推广种植3年以上再采收。

三叉苦药材是三九胃泰、999 感冒灵等中成药的主要原料，市场需求量较大。主要是收集野生资源来供应市场需求，多年的采收导致野生三叉苦资源逐年减少。为此，大力推广三叉苦产业化、规范化、生态化种植迫在眉睫。国家相关部门也出台了很多中药材种植的政策措施和制订了相关标准，其目的是大力推广人工栽培技术。

资源调研显示，三叉苦在广东省和广西壮族自治区野生资源分布广泛，同时国家对林下经济扶持力度较大，可以考虑在适宜的林下或者间伐部分高大乔木，采用林下种植或生态种植，使三叉苦的生长有一定的光照环境［4-8］。生态种植即在三叉苦原生环境中适度间伐低矮灌木和高大乔木，然后再补充一定数量的三叉苦植株，使其资源量群落达到平衡的状态；林下种植即在适宜产区仿原生态的种植模式，以林地自然环境资源为基础，在不影响林木前提下，利用自然条件进行合理种植［9-11］。