杜 响 陈海敏 秦 欣 许万涛 骆其君

（宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315832）

酸雨作为一个全球性的环境问题，近几十年随着化石燃料的使用而变得愈加严重［1-2］。同欧洲和北美一样，由于化石燃料大量消耗，我国已成为世界上受酸雨影响的重灾区之一［3］。在我国南方，最易受酸雨影响的地区遭受了pH＜5的酸雨污染［4-5］。特别是浙江省宁波和金华市曾受到大量酸雨入侵，雨水pH值分别低于4.74和4.12，尤其是象山县，2021年雨水的pH值达到了3.98［6］。酸雨可直接破坏植物细胞膜，使植物的代谢功能受到抑制，进而影响植物形态结构［7］。

生活在潮间带的大型海藻，由于潮汐的每日涨落，周期性的在涨潮时淹没在海水中，在退潮时暴露在空气中。当潮间带大型海藻于低潮期暴露在空气中时，经常会直接遭受pH 值为3.24～6.56 的酸雨胁迫，而且酸雨胁迫往往持续数小时［8］。研究表明，模拟酸雨不仅导致冬青细胞膜透性增加［9］、茶树（Camellia sinensis）幼苗叶绿素a和类胡萝卜素含量减少［10］，而且使夏枯草（Prunella vulgaris）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性呈现先上升后下降趋势［11］；pH值4和5的模拟酸雨处理会使坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）光合作用和呼吸作用速率下降，导致坛紫菜叶状体的死亡［12］；pH值4.4的模拟酸雨显著抑制了裂片石莼（Ulva fasciata）的最大光化学量子产量（maximal photochemical quantum yield of PSⅡ，Fv/Fm）、暗呼吸及光合放氧速率［13］。短期酸雨引起的低pH值海水导致大型海藻种类减少，进而导致珊瑚藻属（Corallina）物种泛滥［8］；频发的酸雨甚至可能是马尾藻床衰退的原因之一［14］。可见，酸雨对海洋生态系统产生了不可忽略的影响。

经典的绿藻是按照形态、结构进行分类，浒苔为单层细胞组成的细长中空管状，如浒苔（Enteromorpha prolifera）、肠浒苔（E.intestinalis）；石莼为双层细胞组成的片状，如石莼（Ulva lactuca）、蛎菜（U.conglobata）［15］。在中国海藻志中也采用该分类及命名［16］。Hayden等［17］依据系统发育进化树中Enteromorpha与Ulva相互交叉分布，而合并为一属Ulva。酸雨胁迫对潮间带大型海藻形态变化、生理特性及存活影响等的研究鲜见报道。且与红藻、褐藻相比，近海绿藻的种类及生物量在逐渐增加，且更为常见。因此，本研究以潮间带常见绿藻为试验材料，研究不同pH值的模拟酸雨对潮间带常见绿藻光合作用的影响，同时测定其光合色素、可溶性蛋白和可溶性糖含量及抗氧化酶活性，探讨潮间带常见绿藻对酸雨的生理生化响应，以期为研究潮间带大型海藻受环境胁迫的影响及其群落变化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浒苔（E.prolifera）、石莼（U.lactuca）、长石莼（U.stenophylla）、蛎菜（U.conglobata）于2021 年2 月至2022年5月采自浙江省东极岛（122.6°E，30.1°N）与南麂列岛（121.3°E，27.3°N）。采回实验室后，选取大小和形态较一致的藻体，用灭菌海水反复冲洗，去除附生杂藻，在光照培养箱中进行培养，培养温度为20 °C，光照强度为100 µmol·m-2·s-1，光照周期为12 h 光照/12 h黑暗。每日更换培养海水。

1.2 试验仪器

GXZ 型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂；WATER-PAM 叶绿素荧光仪，德国Walz 公司；Nikon Eclipse Ti 倒置荧光显微镜，尼康仪器（上海）有限公司；3001 酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；1-16K离心机，德国Sigma公司；PHS-3E型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FiveEasy Plus FE38 电导率仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验设计

根据浙江省自然降雨记录［18］，将硫酸与硝酸按体积比配制成母液，并用蒸馏水将母液稀释成酸性水溶液，得到pH 值分别为6.3、5.6、4.5、4.0 和3.5 的模拟酸雨［19］。

选择状态良好的绿藻，用滤纸吸干表面水分后，放入绿藻与模拟酸雨质量比为1∶100 的培养皿中分别处理5、15、30、60、120、240、360 min。以自然海水（盐度25，pH 值8.1）作为对照，试验设置3 组重复，培养温度为20 °C，光照强度为100 µmol·m-2·s-1。

根据叶绿素荧光参数及形态观察的结果，选择pH值4.5 的模拟酸雨胁迫进行浒苔与石莼的可溶性蛋白、可溶性糖含量及抗氧化酶活性等生理响应试验。

1.4 生理生化指标测定及形态观察

1.4.1 叶绿素荧光参数测定 暗处理15 min后，使用WATER-PAM 叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光诱导曲线，记录光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ，PS Ⅱ）的Fv/Fm值。

1.4.2 相对电导率、质壁分离率测定及形态学观察利用Nikon Eclipse Ti 倒置荧光显微镜观察模拟酸雨处理后绿藻细胞形态变化并拍照；参照郝再彬等［20］的方法，用FiveEasy Plus FE38电导率仪测定电导率。

1.4.3 色素的提取及测定 参考Moran 等［21］的方法并稍作改进。称取模拟酸雨处理后的藻体0.1 g（鲜重）用10 mL 无水甲醇4 ℃萃取24 h，提取液5 000 r·min-1离心10 min后，取上清于酶标仪上进行检测，参比液为提取剂空白溶液。根据公式（1）［22］、公式（2）［23］计算叶绿素a（chlorophylla，Chla）与类胡萝卜素（carotenoids，Car）的含量。

式中，A750、A665、A652、A510、A480分别为波长750、665、652、510、480 nm 处的吸光度，最后根据藻体及甲醇的用量计算出Chla与Car的含量（mg·g-1）。

1.4.4 可溶性蛋白和可溶性糖含量的测定 可溶性蛋白和可溶性糖含量分别采用南京建成生物工程研究所蛋白检测试剂盒（A045-2）考马斯亮蓝法、植物可溶性糖检测试剂盒蒽酮比色法测定［24］。

1.4.5 抗氧化酶活性的测定 抗氧化酶活性均采用生物试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。其中，SOD 活性利用A001-3-2 总超氧化物歧化酶测定试剂盒进行测定；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性利用A084-3-1过氧化物酶测定试剂盒进行测定；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性利用A-007-1-1 过氧化氢酶测定试剂盒进行测定［25］。

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2019 整理数据，利用SPSS 26.0 软件进行单因素ANOVA 分析，采用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 绿藻叶绿素荧光参数对不同pH 值模拟酸雨的响应

由图1 可知，随着模拟酸雨pH 值降低及处理时间延长，4 种绿藻Fv/Fm总体均呈下降趋势。与对照组相比，pH 值6.3、pH 值5.6 的模拟酸雨处理4 种绿藻，仅pH 值5.6 的模拟酸雨处理长石莼6 h 及处理浒苔4 h有极显著差异（P＜0.01），其余均无显著差异（P＞0.05）；pH值3.5的模拟酸雨处理1 h，石莼＞长石莼，其余绿藻Fv/Fm几乎趋近于0。

图1 不同pH值的模拟酸雨对4种绿藻Fv /Fm的影响Fig.1 Effects of simulated acid rain at different pH on Fv /Fm of four species of green seaweeds

由图2可知，pH 值4.5的模拟酸雨处理过程中，石莼相较于其他绿藻表现出良好的耐酸性，但浒苔和长石莼间无显著差异（P＞0.05）。酸雨处理6 h，石莼、蛎菜、长石莼、浒苔的Fv/Fm依次为0.556、0.471、0.321、0.285，其中，浒苔和蛎菜、石莼间均具有极显著差异（P＜0.01）。

图2 pH值4.5的模拟酸雨对4种绿藻Fv /Fm的影响Fig.2 Effects of simulated acid rain at pH 4.5 on Fv /Fm of four species of green seaweeds

2.2 绿藻相对电导率、质壁分离率及藻体形态对不同pH值的模拟酸雨的响应

浒苔相对电导率与酸度呈正相关，pH 值越低其相对电导率越大，且相对电导率随着胁迫时间的增加而变大。不同pH值的模拟酸雨处理浒苔，其相对电导率均高于对照组，pH 值3.5 的模拟酸雨处理6 h 的相对电导率最大，为98.3%，和对照组相比差异极显著（P＜0.01）（图3-A）。经过pH 值4.5 的模拟酸雨不同时间处理，与对照组（图3-B）相比，浒苔细胞发生不同程度的质壁分离，酸雨处理2 h，有60%细胞发生质壁分离，6 h 时，几乎所有细胞发生质壁分离（图3-B～F）；对石莼而言，酸雨处理6 h，仅有50%的细胞发生了质壁分离（图3-G～I）；模拟酸雨相同处理时间下，浒苔质壁分离率大于石莼。由图3-J～L 可知，在酸雨处理过程中，石莼细胞不仅发生质壁分离，而且双层细胞紧密排列的藻体会形成囊泡状突起，进而使藻体由双层细胞分裂成单层，此时其Fv/Fm趋近于0。

图3 模拟酸雨对浒苔、石莼细胞膜透性、质壁分离率及藻体形态的影响Fig.3 Effects of simulated acid rain on cell membrane permeability，plasma wall separation rate and seaweeds morphology of E.prolifera and U.lactuca

考虑到数据采集及试验时间的延续，本研究认为采用pH 值4.5 的模拟酸雨作为胁迫方法较为合理。因此后续试验中，在不同处理时间条件下，研究4种绿藻在pH值4.5的模拟酸雨胁迫下的生理响应。

2.3 绿藻色素含量对pH 值4.5 的模拟酸雨胁迫的响应

pH 值4.5的模拟酸雨对4种绿藻色素的影响与处理时间有关，与对照组相比，酸雨处理降低了绿藻的色素含量。6 h 时，对叶绿素a含量而言，石莼＞长石莼＞浒苔＞蛎菜，与对照组相比差异显著（P＜0.05）（表1）。由表2 可知，酸雨处理6 h，除长石莼外，其余绿藻Car含量与浒苔并无显著差异（P＞0.05），与对照组相比，长石莼的Car降幅依次小于蛎菜、石莼、浒苔。

表1 叶绿素a含量对pH值4.5的模拟酸雨胁迫的响应Table 1 Response of chlorophyll a content to simulated acid rain stress at pH 4.5 /（mg·g-1）

表2 类胡萝卜素含量对pH值4.5的模拟酸雨胁迫的响应Table 2 Response of carotenoids content to simulated acid rain stress at pH 4.5 /（mg·g-1）

2.4 绿藻可溶性蛋白含量和可溶性糖含量对pH 值4.5的模拟酸雨胁迫的响应

由图4可知，与对照组相比，pH 值4.5的模拟酸雨处理2 h 显著增加了4 种绿藻的可溶性蛋白含量（P＜0.05）。在6 h时，各绿藻的可溶性蛋白含量达到最大，石莼、长石莼、蛎菜、浒苔含量分别增加了1.46、2.48、1.58、1.56 倍，可溶性蛋白含量表现为石莼＞蛎菜＞长石莼＞浒苔；随着酸雨处理时间的延长，绿藻的可溶性糖含量总体下降，6 h 时，分别降到对照组的54.46%、60.78%、69.56%、55.19%，且石莼、长石莼、蛎菜的可溶性糖含量是浒苔的3.50、3.66、4.37 倍，石莼、长石莼、蛎菜均与浒苔之间差异显著（P＜0.05）。

图4 可溶性蛋白含量和可溶性糖含量对pH值4.5的模拟酸雨胁迫的响应Fig.4 Response of soluble protein content and soluble sugar content to simulated acid rain stress at pH value 4.5

2.5 绿藻抗氧化酶活性对pH 值4.5的模拟酸雨胁迫的响应

由图5可知，在处理时间为6 h时，pH值4.5的模拟酸雨处理降低了4种绿藻SOD活性，石莼、长石莼、蛎菜和浒苔的SOD活性较对照分别下降了60.09%、65.74%、68.85%、66.02%（均为P＜0.05），SOD 活性表现为石莼＞浒苔＞长石莼＞蛎菜；与SOD 活性变化趋势相反，酸雨提高了4 种绿藻POD 活性，且随着处理时间的增加而增加，与对照组相比，6 h时，石莼、长石莼、蛎菜和浒苔POD活性增至36.08、32.93、31.94、31.16 U·mg-1·prot-1，且与对照间差异显著（P＜0.05），并且石莼与浒苔之间差异显著（P＜0.05）；4 种绿藻CAT 活性与酸雨处理时间呈负相关，6 h 时，石莼、长石莼、蛎菜和浒苔CAT活性分别下降至对照组的48.21%、48.86%、57.52%、32.57%，此时，浒苔 CAT 活性仅为石莼的69.81%、长石莼的69.26%、蛎菜的71.25%，浒苔分别与石莼、长石莼、蛎菜之间差异显著（P＜0.05）。

图5 抗氧化酶活性对pH值4.5的模拟酸雨胁迫的响应Fig.5 Response of antioxidant enzyme activity to simulated acid rain stress at pH value 4.5

3 讨论

研究表明，叶绿素荧光检测可以作为一种快速、无损的检测植物非生物和生物胁迫的方法［26-28］。最大光化学量子产量（Fv/Fm）作为荧光分析中常用的光合参数，代表了光系统Ⅱ（PS Ⅱ）的光化学效率，可以反映植物在逆境中受胁迫的情况［29］。在本研究中，浒苔、石莼等潮间带常见绿藻在模拟酸雨的胁迫下，随着酸雨pH 值的减小和处理时间的延长，其Fv/Fm总体均呈下降趋势，这与前人研究结果一致［19］。与对照组相比，pH值6.3的模拟酸雨处理下藻体Fv/Fm无明显差异，但其余pH 值的模拟酸雨处理下Fv/Fm则存在显著差异，说明轻度酸雨（pH 值5.6）对绿藻的光合作用未产生显著影响，而中度酸雨（pH 值4.5）和重度酸雨（pH 值4.0、3.5）均产生显著影响。在模拟酸雨胁迫下，随着酸度增加和处理时间延长，浒苔细胞相对电导率显著升高。特别是pH值4.0和3.5的模拟酸雨处理5 min 后其相对电导率升高达到显著水平（P＜0.05），说明重度酸雨胁迫对浒苔的细胞膜系统损害非常严重，可能会影响光合系统的电子传递效率，抑制其光合作用。与Fv/Fm类似，试验藻体叶绿素a及类胡萝卜素含量也随处理时间的延长而下降，与前人研究结果一致［30-31］。可能是由于叶绿素降解基因上调，导致叶绿素含量降低，从而迫使藻类的光合作用下降［32］。说明酸雨从根本上阻碍了植物赖以生存的光合作用。此外，在酸雨胁迫下，叶绿体结构和类囊体可能被破坏，阻碍了藻类的光合运输，最终抑制藻类的光合作用［33-34］。根据不同pH 值的模拟酸雨条件下绿藻Fv/Fm及细胞渗透性测定结果，本研究认为采用pH 值4.5 的模拟酸雨作为胁迫方法较为合理。

酸雨对植物的影响机理在于其使植物膜透性增加，自由基代谢平衡失调，进而导致生物膜系统受损，以及膜保护酶活性和膜保护物质含量降低［35］。可溶性糖、可溶性蛋白作为植物细胞内重要的渗透调节物质，对维持细胞渗透压、稳定生物大分子的结构和功能起重要作用［36］。一定程度上可溶性糖又具有保护植物细胞膜、原生质体以及酶类的功能。研究发现，与正常情况相比，模拟酸雨处理植物中的POD 活性及可溶性蛋白含量显著增加［37-38］。与之类似，本研究发现，随着处理时间的增加，模拟酸雨提高了绿藻可溶性蛋白的含量及POD 活性，这在一定程度上对绿藻应对酸雨胁迫有利，而本研究中可溶性糖含量和SOD、CAT活性在酸雨条件下出现下降的趋势，表明酸雨胁迫显著抑制了绿藻的可溶性糖含量和SOD、CAT活性，这可能是由于酸雨使植物叶片细胞内环境pH 值和原生质等电点降低，从而使酶活性偏离最适pH 值，同时改变了酶的带电性质和底物电离状况或破坏了酶结构，使酶活性钝化［35］。进而对浒苔、石莼等绿藻产生了不良影响。

生理特性作为植物固有属性，在一定程度上既反映出海藻在酸雨胁迫下的基因表达水平变化，也体现出其形态特征的改变［39］。自然界进化史表明亲缘关系越近的海藻其生理特性越相似。然而本研究发现，随着模拟酸雨pH值的降低及处理时间延长，浒苔与石莼生理差异愈加明显，并且石莼相较于浒苔受酸雨影响较小，一定程度上表明石莼对酸雨的耐受性大于浒苔。本研究结果支持“浒苔与石莼为两种不同的属”这一结论［16］。然而以内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）序列和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL）基因序列构建的系统发育进化树结果显示，浒苔和石莼相互交错分布，因此有学者认为二者应该同属于石莼［17，40］。可能是由于石莼大多为双层细胞组成的膜状体，藻体相对短而厚，细胞壁比浒苔发达，有利于抵抗酸雨的侵蚀；而浒苔为单层细胞组成的中空管状体，藻体相对长而薄，对酸雨耐受性较石莼弱。此外，当浒苔、石莼历经干出到酸雨胁迫时，其干出复水性能以及浒苔、石莼分布的区域生态可能也是导致浒苔比石莼耐酸性弱的原因之一，具体原因还需进一步试验论证。本研究表明，模拟酸雨胁迫下，石莼、蛎菜与长石莼之间同样存在差异，这可能是由于石莼、蛎菜多分布在潮间带的高中潮带，较长时期暴露在光温等环境剧烈变化的条件下，细胞壁厚，对于酸雨的响应表现为较强的耐受性；而长石莼分布在低潮带的石沼或浅海中，藻体较薄，对于酸雨的响应与石莼、蛎菜有差别，耐受性较差。频繁的酸雨会导致水体酸化，甚至可能导致潮间带生态系统结构以及功能的紊乱。酸雨胁迫下植物的光合作用和生长会受到影响，长此以往势必导致生态系统生产力的衰退［41］。当酸雨胁迫潮间带海藻时，盐胁迫、干旱胁迫等也常常伴随着潮涨潮落袭击着潮间带海藻，对于多重胁迫下潮间带海藻生理特性及群落变化还需进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，和对照组相比，pH 值4.0 和pH值3.5 的模拟酸雨抑制了4 种绿藻的Fv/Fm，但pH 值6.3 的模拟酸雨处理下4 种绿藻Fv/Fm无明显差异；绿藻相对电导率及质壁分离率也随着模拟酸雨pH 值的降低及处理时间延长而逐渐上升。其中，pH 值6.3 和pH 值5.6 的模拟酸雨处理2 h 浒苔相对电导率产生显著差异，但pH 值4.0 和pH 值3.5 的模拟酸雨仅处理5 min 便达到极显著水平。说明采用pH 值4.5 的模拟酸雨作为胁迫方法探讨不同处理时间条件下海藻的响应机制较为合理。pH 值4.5 的模拟酸雨提高了绿藻可溶性蛋白含量及POD 活性，但降低了色素含量、可溶性糖含量和SOD、CAT活性，且随时间延长降低幅度愈加明显。此外，3 种石莼对模拟酸雨的耐受性均高于浒苔。

致谢：感谢云南省微藻重点实验室工作人员对本研究提供的帮助！