唐艺文 陈 谦 王 钢 付 孟 黄 敏，* 王 丹 高 鹏

（1西南科技大学，四川 绵阳 621010；2四川省原子能研究院，四川 成都 610101；3辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木。传统中药以杜仲树皮入药，经学者研究发现杜仲叶和杜仲树皮具有相似的活性成分［1］，二者均具有补肝益肾、强筋健骨、安胎等功效［2］。杜仲叶是杜仲的干燥叶片，早被《中华人民共和国药典》（2005版）收载入药［3］。同时，杜仲叶作为一种药食同源物质，具有良好的保健功能［4］，其含有的绿原酸具有抗高血压和降血脂作用［5-7］，芦丁具有较强的降压和舒张血管作用［8-9］。作为我国的特有品种，杜仲在我国的种植面积占世界总种植面积的99%以上［10］，主要分布于四川、陕西、湖北等地；同时，在国际市场上，杜仲也是被许多国家认可的中药材品种，2019年我国杜仲出口量达1 084.6 t，其健康价值倍受国际广泛好评［10］。

相关数据显示，种植1亩杜仲的纯收入可达3 500元以上［11］，经济效益良好。同时，原国家林业局发布了相关文件，标志着杜仲产业进入国家整体统筹战略层面［11］。四川省制定了2025年中药材产业发展目标：中药材种植面积达850万亩、年总产值达300亿元以上［12］。杜仲作为川产道地药材之一［13］，具有良好的发展空间。目前，除了传统用于药用成分提取、生产杜仲胶外，作为药食同源的杜仲在保健食品、饮料等领域也已打开局面［11］。

中药材在其储藏过程中易发生腐败、虫蛀、霉变等现象［14］，会造成药材的药效降低，储藏时间缩短等不良影响。传统中药材的贮藏养护方法存在许多潜在问题与安全隐患，正逐步被市场及政府所规范或淘汰。同时，加强中药材质量控制、大力推动中药质量提升是国家关注的重点工作内容［15］。需要新的贮藏养护方法满足当前需求，因此研发适合中药材储藏的新技术是当前研究的热点内容。

辐照灭菌技术是一种利用放射源产生的γ 射线、加速器产生的高能电子束和X 射线辐照农产品、食品等，达到抑制发芽、推迟成熟、杀虫灭菌和改进品质等作用的技术［16-17］。相较于传统的灭菌技术，辐照灭菌是一种绿色、安全、卫生、经济、高效的“冷杀菌技术”，在食品、农产品的贮藏中已得到广泛应用［18-23］。《中华人民共和国药典》将辐照技术作为灭菌的一种处理手段，可用于不受辐射破坏的原料药及成品等的灭菌［24］。其中高能电子束辐照技术除具有60Co-γ辐照技术相应的优势外，还具有操作简便、处理效率高、无放射源衰减、安全性更高等优点，与当前中药材贮藏养护的需求相切合［25］。

辐照技术在中药及中药制品的灭菌和加工上已有相关研究报告，何毅等［26］研究发现，2 kGy 剂量电子束辐照能有效降低麦冬中微生物数量，对其色泽、风味品质、活性成分含量及抗氧化活性无显著影响；徐光临等［27］研究发现，黄岑和南星经60Co-γ 射线辐照后灭菌效果理想，且25 kGy 辐照对黄芩和南星有效成分无影响；蔡汶莉［28］研究发现，高能电子束辐照能够有效杀灭百合和山银花药材中的微生物，对药材品质的影响也较小。可见，辐照技术可在达到灭菌效果的同时，保证药材药效。

目前，辐照技术在杜仲叶贮藏加工中的研究较少，梁倩等［29］发现经不同剂量60Co-γ射线辐照后，杜仲等中药材电子自旋共振（electron paramagnetic resonance，ESR）波谱峰信号强度与吸收剂量均呈二次项关系增长，即辐照产生的自由基含量随着吸收剂量的增加而增加，但未对其品质进行整体探究。本研究以杜仲叶为研究对象，通过测定不同剂量辐照前后其水分、浸出物、微生物总量、绿原酸含量、芦丁含量、指纹图谱相似度来综合评价电子束辐照对杜仲叶品质的影响，旨在为电子束辐照加工技术在杜仲叶贮藏应用中的质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲叶，购于四川省中兴药业有限公司；绿原酸对照品（98%）、芦丁对照品（98%），购于成都埃法生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，购于北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇、磷酸等色谱纯试剂，购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；无水乙醇等分析纯试剂，购于成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000双三元、二维液相色谱仪系统，美国赛默飞世尔科技有限公司；RHCX-350超声波清洗仪，济宁荣汇超声波设备有限公司；GE60DA 高压蒸汽灭菌锅，美国致微公司；NH300 色差仪，深圳市三恩时科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐照剂量选择 为确保中药的安全、有效、质量稳定，根据“中药辐照灭菌技术指导原则”（2015年第86号）［30］，确定拟采用的最大辐照剂量不超过10 kGy。本试验设置2、4、6、8 kGy 4 个剂量组和CK（0 kGy）对照组。

1.3.2 药材处理 杜仲叶采用复合材料真空包装（20 cm×30 cm，30丝）密封，每袋50 g，每个剂量各3袋，送至重庆恒德辐照技术有限公司采用高能电子加速器（电子束能量10 MeV，功率20 kW）进行辐照处理，辐照剂量设定为2、4、6、8 kGy，以未辐照样品为对照（CK），经重铬酸银剂量计测定样品的实际吸收剂量分别为2.15、4.05、6.88、8.62 kGy，下文均以设定剂量进行表示。杜仲叶辐照后进行粉碎，过65目筛。

1.3.3 微生物含量测定 测定辐照前后杜仲叶中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。参照2020 年版《中华人民共和国药典》四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法［24］。

1.3.4 高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）测定活性成分含量和指纹图谱

1.3.4.1 对照品溶液 精密称取绿原酸标品，加入甲醇，配置成浓度为0.22 mg·mL-1的溶液，即得。精密称取芦丁标品，加入甲醇，配置成浓度为0.093 mg·mL-1的溶液，即得。

1.3.4.2 供试品溶液的制备 精密称取各剂量样品粉末0.5 g，加入10 mL甲醇，称重，室温下超声提取40 min，取出，冷却，称重，用甲醇补足重量，过滤，取滤液，得供试品溶液；各辐照剂量制备3个平行。

1.3.4.3 色谱条件 色谱柱：Hyersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相：以0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：10 µL。绿原酸的检测波长为327 nm，芦丁的检测波长为208 nm，指纹图谱检测波长208 nm。

表1 流动相时间程序Table 1 The time program of mobile phase

1.3.4.4 含量测定 设置待测液进样量10 µL 进行液相色谱仪测定，并采用外标法计算样品中绿原酸与芦丁的含量。

1.3.4.5 指纹图谱采集 按上述方法制备对照品和供试品溶液，设置进样量10 µL、检测波长208 nm 进行测定，得到杜仲叶的HPLC指纹图谱。

1.3.5 色泽测定 参照吕绪桢等［31］的方法，通过色差仪测定杜仲叶样品的色泽，记录亮度值L*值、红绿值a*值、黄蓝值b*值，按照公式计算饱和度C和总色差ΔE：

1.3.6 水分、浸出物含量测定 杜仲叶水分和浸出物含量参照2020 版《中华人民共和国药典》中的方法进行测定［24］。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0 软件对3 次重复试验所得数据进行显著性分析和相关性分析；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版进行HPLC指纹图谱分析。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照对杜仲叶药材微生物数量的影响

根据2020年版《中华人民共和国药典》规定［24］：非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准为需氧菌总数不超过103CFU·g-1，霉菌和酵母菌总数不超过102CFU·g-1，对控制菌未做统一规定。由微生物测定结果（表2）可知，未经辐照的杜仲叶样品中微生物数量大于限量标准，不符合药典要求。当电子束辐照剂量达到2 kGy时，杜仲叶的微生物数量下降至药典中所规定的非无菌药用原料及辅料的微生物限量标准，并且辐照剂量越大，杜仲叶中微生物数量越少，当辐照剂量为4 kGy时，微生物数量均降低至检测限（10 CFU·g-1）以下。

表2 电子束辐照处理对杜仲叶微生物总数的影响Table 2 Effect of electron-beam irradiation on the microbial loads of Eucommia ulmoides leaves

2.2 电子束辐照对杜仲叶药材中活性物质含量的影响

绿原酸和芦丁是杜仲叶主要活性成分，其含量是评价杜仲叶品质的重要指标。由表3 可知，辐照前后杜仲叶中绿原酸含量在0.21%～0.28%之间，均大于0.080%，符合2020年版《中华人民共和国药典》要求［24］。辐照前后杜仲叶中芦丁含量在0.07%～0.09%之间，波动较小。与CK 相比，2、4、6 kGy 剂量电子束辐照处理后样品中绿原酸和芦丁含量显著增加（P＜0.05），但变幅较小；当辐照剂量为8 kGy 时，二者与CK 相比差异不显著（P＞0.05）。相关性分析发现（表4），绿原酸、芦丁含量与辐照剂量之间呈负相关，但相关性不显著（P＞0.01）。

表3 电子束辐照对杜仲叶绿原酸、芦丁的影响Table 3 Effect of electron-beam irradiation on the chlorogenic acid content and rutin content of Eucommia ulmoides leaves

表4 辐照剂量、绿原酸及芦丁含量间的相关性Table 4 Corrlation analysis among absorbed dose，chlorogenic acid and rutin content

2.3 电子束辐照对杜仲叶指纹图谱的影响

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的HPLC 图谱进行数据分析，以未辐照（CK）杜仲叶作为参照图谱，进行多点校正、自动匹配（时间窗宽度为0.01），标定16 个共有峰作为杜仲叶的特征峰，生成对照图谱R，见图1。其中7号峰为绿原酸，11号峰为芦丁。将经不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的指纹图谱与对照图谱进行比较，计算得到与对照指纹图谱的相似度，结果见表5。以7 号峰绿原酸为参比峰（设定其相对保留时间和相对峰面积为1），计算其余各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表6、表7。结果表明，不同剂量电子束辐照处理的杜仲叶指纹图谱相似度范围为0.979～0.998，杜仲叶各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）范 围 为0.09%～0.40%，相对峰面积的RSD 范围为4.57%～26.82%，表明在2～8 kGy 辐照剂量范围内，杜仲叶中的成分仍保持较好的一致性。

图1 杜仲叶的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms and reference of Eucommia ulmoides leaves

表5 不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的HPLC相似度Table 5 HPLC chromatograms similarity evaluation of Eucommia ulmoides leaves irradiated by different absorbed doses of electron-beam

表6 杜仲叶HPLC指纹图谱中各共有峰的相对保留时间Table 6 Characteristic peak relative retention time of Eucommia ulmoides leaves

表7 杜仲叶的HPLC指纹图谱中各共有峰的相对保留面积Table 7 Characteristic peak relative retention area of Eucommia ulmoides leaves

2.4 电子束辐照对杜仲叶色泽的影响

色泽是反映中药材品质的重要指标之一。辐照前后各剂量下的L*值、a*值、b*值、C值和ΔE值见表8，各指标间相关性结果见表9。结果表明，与CK 相比，经2、4 kGy 辐照后，杜仲叶的L*值显著增加（P＜0.05），但总体数值变化幅度较小，6、8 kGy辐照剂量下的L*值无显著变化（P＞0.05）。相关性分析发现，L*值与所选辐照剂量（2～8 kGy）之间无显著相关性（P＞0.05）。

表8 电子束辐照对杜仲叶色泽的影响Table 8 Effect of electron-beam irradiation on Hunter’s color of Eucommia ulmoides leaves

表9 辐照剂量与色泽的相关性Table 9 Corrlation analysis among absorbed dose and Hunter’s color

a*值表示红绿值，经测定均为正值，即杜仲叶主要呈现为红色。与CK相比，经2 kGy剂量辐照时，a*值无显著变化（P＞0.05），经4 kGy 剂量辐照时显著降低（P＜0.05），达到最低值。低剂量辐照下（辐照剂量小于5 kGy），随着辐照剂量的增加，a*值减小。与CK相比，经6、8 kGy辐照后，a*值显著升高（P＜0.05）。a*值与辐照剂量之间呈显著正相关（P＜0.01）。

b*值表示黄蓝值，测定结果显示杜仲叶略微偏黄。各剂量辐照后均呈现显著变化（P＜0.05）。低剂量辐照时（辐照剂量小于5 kGy），随着辐照剂量的增加，b*值减小，4 kGy 时最低。与CK 相比，经6、8 kGy 剂量辐照后，b*值显著升高（P＜0.05）。b*值与辐照剂量之间无显著相关性（P＞0.01）。

C值表示色彩饱和度，与CK 相比，经2 kGy剂量辐照时无显著变化（P＞0.05）；4、6、8 kGy 剂量辐照下，C值发生显著变化（P＜0.05），并且在4 kGy时C值最低。

ΔE值为总色差，表示经不同剂量电子束辐照处理后杜仲叶颜色变化，越大表示与对照组杜仲叶颜色差异越明显。经各剂量辐照后，测得ΔE值的范围为1.14～1.91，各剂量下的ΔE值均无显著差异（P＞0.05），且与辐照剂量之间无显著相关性（P＞0.01）。当辐照剂量为2 kGy时，ΔE为1.14，与CK差异最小，即2 kGy辐照剂量对杜仲叶的色泽影响最小。

2.5 电子束辐照对杜仲叶理化性质的影响

电子束辐照后杜仲叶中水分、浸出物含量的测定结果见表10。辐照前后杜仲叶中水分含量范围为7.02%～10.16%，水分含量最高的是CK，达10.16%，随着辐照剂量的增加，杜仲叶中水分含量呈现显著下降趋势（P＜0.05），辐照剂量为8 kGy 时，水分含量为7.02%，与CK 相比下降了3.14 个百分点。由表11可知，杜仲叶水分含量与辐照剂量呈显著负相关（P＜0.01）。

表10 电子束辐照对杜仲叶水分、浸出物含量的影响Table 10 Effect of electron-beam irradiation on moisture and extracts content of Eucommia ulmoides leaves /%

表11 辐照剂量与杜仲叶水分、浸出物含量的相关性Table 11 Corrlation analysis among absorbed dose，moisture and extracts content

醇溶性浸出物含量范围为30.17%～34.83%。CK组醇溶性浸出物含量为30.92%，当辐照剂量为2 kGy时，醇溶性浸出物含量与CK 相比无显著差异（P＞0.05）。随着辐照剂量的增大，醇溶性浸出物含量呈现先增加再减少趋势，在辐照剂量为4 kGy 时，测得浸出物含量达到最高峰值34.83%，8 kGy 时达到最低值30.17%。由表11 可知，醇溶性浸出物含量与所选辐照剂量（2～8 kGy）之间无显著相关性（P＞0.01）。

3 讨论

3.1 电子束辐照对杜仲叶微生物数量的影响

微生物是影响杜仲叶贮藏期的重要因素，高能电子束具有较高能量的电子束，能够诱导活细胞中细胞基因组、生理生化和形态发生改变，从而控制杜仲叶中的微生物数量［32］。本研究表明，电子束辐照能显著降低杜仲叶药材中的微生物数量，在辐照剂量为2 kGy时，杜仲叶中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均降低至《中华人民共和国药典》中规定的微生物限量标准以下［24］，并且随着电子束辐照剂量的增加，对杜仲叶中微生物的抑制作用增强。何毅等［26］研究发现，2 kGy 电子束辐照可有效降低麦冬中微生物数量至药典规定的微生物限度标准以下，与本研究结果一致。表明采用电子束辐照可有效控制中药材中的微生物数量，符合药典中对中药材中微生物含量的相关规定。

3.2 电子束辐照对杜仲叶活性成分含量的影响

绿原酸和芦丁是杜仲叶中的两种主要活性成分，其含量是评价杜仲叶品质的重要因素，其中绿原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抑制肿瘤等生物活性［33］；芦丁作为一种黄酮醇，具有抗炎、抗氧化、保护血管等作用［34］。2020年版《中华人民共和国药典》规定杜仲叶中绿原酸含量不得低于0.080%［24］。本研究发现，各辐照剂量下测得的绿原酸含量均达到药典要求，并且与对照组相比，各辐照剂量下杜仲叶中绿原酸、芦丁含量的变化不大，表明当辐照剂量为2～8 kGy时，杜仲叶中的绿原酸、芦丁含量仍较为稳定，这与徐远芳等［23］对葛根粉、范伟［35］对连翘的研究结论较为一致。

3.3 电子束辐照对杜仲叶HPLC指纹图谱的影响

指纹图谱作为中药质量控制的常用方法，可整体评价中药材成分的稳定性。在中药材辐照灭菌方面，指纹图谱已得到一定的应用，如大黄粉［36］、山银花［37］、连翘［35］、山药［38］等。本研究结果显示，经不同辐照剂量电子束辐照前后的杜仲叶指纹图谱相似度均大于0.90，可见不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的图谱整体较为一致，这与徐远芳等［37］、王强等［39］的研究结果一致。其中，相对峰面积的RSD 在4.57%～26.82%之间，上述结果表明，表明电子束辐照对杜仲叶某些成分的含量产生了不同程度的影响，造成部分化学成分含量的升高或降低，这与张晓彬等［40］对川芎的研究结果较为一致。上述结果表明，与对照相比，经不同辐照剂量的电子束辐照处理后杜仲叶的指纹图谱整体仍较为一致且稳定。

3.4 电子束辐照对杜仲叶理化性质及色泽的影响

水分含量是评价杜仲叶品质的质量指标之一，与药材贮藏时发生的虫蛀与霉变有密切关系［41］。本研究发现，辐照前后杜仲叶中的水分含量均能达到药典中的规定，随着辐照剂量的增加，杜仲叶中的水分含量呈现显著下降趋势。Gani等［42］用γ射线对芸豆淀粉进行辐照后发现其水分含量显著下降，其中红色芸豆的水分含量经10 kGy剂量辐照后下降约44.4%，与本研究结果基本一致。杜仲叶的水分含量随辐照剂量的增加呈显著降低的趋势，原因可能是电子束在穿透样品的过程中会产生一定的能量损耗，导致水分流失［42］；或是电子束辐照造成纤维素结构的破坏［43］，而植物纤维有很强的吸水特性［44］，结构被破坏后可能导致其对水分的吸附作用降低，造成水分减少。辐照前后杜仲叶中的醇溶性浸出物含量均能达到药典中的规定，在一定范围内，随着辐照剂量的增加，浸出物含量增大，与何毅等［26］对黄精的研究结果一致，但用较高剂量辐照时，可能对物质成分产生一定的破坏作用，导致含量降低。

4 结论

本研究结果显示，2 kGy及以上的辐照剂量能有效降低杜仲叶中微生物数量至可接受范围，即2 kGy 为杜仲叶的最低有效辐照剂量。综合评价辐照前后水分、浸出物、色泽及活性成分的变化情况，2 kGy的辐照剂量能保证杜仲叶的微生物数量有效降低，同时对其品质的影响最小。通过比较指纹图谱发现辐照前后杜仲叶整体成分较为稳定。综上，电子束辐照技术是一种能有效控制杜仲叶微生物数量的方法，且在一定的辐照剂量范围内对杜仲叶质量无明显影响。