张小梅 李广录 刘 宇 侯文邦

（河南科技大学，河南 洛阳 471000）

甘薯（Ipomoea batatasLam.）具有耐贫瘠、抗干旱、产出多等优点，被誉为世界第七大重要作物［1］。我国是世界上最大的甘薯生产国，常年种植面积约600万公顷，据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）统计，2018 年我国大陆甘薯的种植面积约占世界甘薯种植面积的29.39%，产量约占世界总产量的57.65%［2-4］。

由于甘薯含有极其丰富的营养物质，且随着人们生活水平的提高，饮食结构趋于多元化、保健化，鲜食型甘薯的市场供应比例不断增长［5-7］。但是甘薯在种植过程中极易受病毒病的影响，甘薯病毒的侵染会对甘薯的产量和品质产生很大危害，更是引起甘薯品种退化的主要原因［8-10］。其中甘薯曲叶病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV）是侵染甘薯的主要DNA 病毒之一，目前在我国普遍存在，被该病毒侵染的甘薯会表现出叶片黄化、叶脉变黄明脉增厚、叶片往上卷曲、叶片出现斑驳等症状［11-12］。SPLCV 的侵染对不同品种的甘薯造成的产量损失可达4.9%～43.3%［13-14］。SPLCV感染的植物在自然条件下可以通过烟粉虱传播病毒，或通过嫁接方式传播病毒，脱毒试管苗在生产大田无隔离的无性繁殖过程中也会重新感染病毒，使甘薯品质下降，严重影响薯农收入［13-15］。在甘薯种植季节，特别是脱毒薯苗大量上市时，如何快速准确地进行甘薯病毒的检测，是实际生产应用中关注的重点。

侧向横流层析系统是典型的即时检测方法，技术简单、快速、低成本，目前已在如绵羊［16］、火鸡［17］、牛肉［18］等多个方面得到应用。但这种检测多用于动物制的食品的相关检测，在植物检测中的运用较少。因此，本研究根据SPLCV的cp基因序列的保守区设计SPLCV检测引物，并将核酸扩增技术与侧向横流层析技术相结合，构建有关SPLCV特异性PCR产物检测的快速层析系统（lateral flow immunochromatography assay，LFIA），使得3 min 内即可观测到扩增结果，旨在为快速检测甘薯样本是否感染SPLCV提供技术支持，并满足大量样本同时检测的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验样品来自河南省洛阳市樊店镇甘薯试验田，采集代表性甘薯病样，田间病株表现为叶片向上卷曲、皱缩等症状，所采样本用液氮处理后于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

羧基磁粒（100 nm），上海羧菲生物医药科技有限公司；结合垫、玻璃纤维、胶板、硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC 膜）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）胶底板，上海金标生物科技有限公司。微量BCA 蛋白定量试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；CTAB 植物基因组DNA 快速提取试剂盒，北京博迈德基因技术有限公司；pBM16A Toposmart 快速克隆试剂盒，爱必信（上海）生物科技有限公司；2×Unitag Master Mix 试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T60 PCR 仪，杭州晶格科学仪器有限公司；JY04S-3D 凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司；KS-900 型超声波清洗仪，宁波新芝生物有限公司；5810R 台式高速离心机，德国Eppendorf 公司；PuriMag MRack 磁力架，厦门普睿迈格生物科技有限公司；HM3030划膜喷金仪、ZQ2002自动斩切机，上海金标生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 引物的设计与合成 从GenBank 中获得SPLCV 的全基因组序列信息，以cp基因作为引物设计区，设计两对引物：S-lF/S-lR、S-2F/S-2R，其中S-2F/S-2R 的5＇分别标记地高辛（digoxin，D）和生物素（biotin，B），具体序列见表1。引物由上海生工生物有限公司合成。

表1 扩增引物序列Table 1 Primer sequence information

1.3.2 甘薯叶片基因组DNA 的提取 按照CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒的操作步骤，完成甘薯叶片DNA的提取，得到的DNA于-20 ℃保存备用。

1.3.3 SPLCVcp基因的克隆 PCR 反应体系共25µL：模板DNA 1 µL，10 µmol·L-1S-1F/S-1R 各 1 µL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，用ddH2O 补体积至25µL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，循环35 次；72 ℃终延伸10 min。反应结束后取5 µL 反应产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，最后将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，确定阳性样本。

切胶回收上一步骤中阳性样本的PCR 产物，并与pBM16A Toposmart 克隆载体进行连接，后转入JM109感受态细胞。选取单菌落进行菌落PCR，扩增体系及方法同1.3.3，确定阳性菌落。将阳性菌落进行扩大培养，并提取质粒DNA进行测序，确定阳性对照质粒。

1.3.4 PCR反应系统优化

1.3.4.1 带标记引物PCR反应退火温度的优化 本研究反应体系共50 µL：S-2F/S-2R（10 µmol·L-1）各1 µL，阳性样本DNA 1 µL，2×Taq PCR Master Mix 25 µL，ddH2O补体积至50 µL。反应条件：94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性30 s，将退火温度设置为 51、53、55、57、59、61 ℃ 6 个梯度，72 ℃延伸30 s，循环 32 次。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4.2 带标记引物对PCR 检测系统特异性检测

提取感染SPLCV 阳性样本、甘薯无症状1 号病毒（Sweetpotato symptomless virus 1，SPSMV-1）阳性样本和甘 薯 杆 状DNA 病 毒B（Sweet potato Badnavirus B，SPBV-B）阳性样本的总DNA，甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）阳性样本、甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）阳性样本和甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）阳性样本的cDNA，利用S-2F/S-2R 对其进行特异性检测。

1.3.5 羧基磁粒抗体包被时最佳抗体投入量的优化 取3支离心管各加入0.1 mg的羧基磁粒，用200 µL硼酸盐缓冲液（pH值7.6）冲洗，室温下磁分离，弃去上清液；用100 µL 硼酸盐缓冲液（pH 值7.6）重悬羧基磁粒后，加入5 mg·mL-11-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亚 胺 盐 酸 盐［1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl］溶液15 µL，超声处理25 min，然后分别加入15、20、25 µg地高辛单克隆抗体，40 kHz超声处理50 min。超声结束后，室温下磁分离，取上清液，用微量BCA 蛋白定量试剂盒检测抗体的偶联量及偶联率。

1.3.6 划线与喷涂 将NC 膜固定于PVC 胶底板上，将链霉亲和素和山羊抗小鼠二抗分别以2 µL·cm-1的速度划于检测线与质控线处，37 ℃烘干4 h 后备用。将包被有地高辛单克隆抗体的羧基磁粒以7 µL·cm-1的速度喷涂于结合垫上，晾干备用。

1.3.7 层析检测系统的组装 将上样垫、制备好的结合垫、吸水纸依次组装在已经划线的NC 膜上，并切成3 mm宽的试纸条备用。

1.3.8 阳性对照质粒的检测 以阳性对照质粒为模板，利用引物S-2F/S-2R扩增出的产物分别用2.5%琼脂糖电泳与组装好的试纸条进行检测，3 min后观察检测结果。质控线出现条带说明结果有效，检测线出现条带为阳性，不出现条带为阴性。

1.3.9 层析检测系统灵敏性检测 从已确认SPLCV感染的阳性样本中提取DNA，利用微量紫外分光光度计（德国WTW 公司）测定DNA 浓度。将DNA 浓度分别稀释至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng·µL-1，在最适条件下进行PCR 扩增，扩增产物分别用琼脂糖电泳和层析系统进行检测。

1.3.10 SPLCV层析检测系统对田间样品的检测 采集9份疑似感染SPLCV的甘薯样本，提取总DNA，在最适条件下利用引物S-2F/S-2R 进行PCR 扩增，扩增产物分别用琼脂糖电泳和层析系统进行检测。

2 结果与分析

2.1 SPLCV cp基因阳性对照质粒的构建

以感染SPLCV 的阳性样本DNA 为模板，使用S-1F/S-1R 进行PCR 扩增后，凝胶电泳结果如图1 所示，其扩增产物的条带所在位置与目的条带一致。PCR产物连接载体后进行测序，测序结果与GenBank 中收录的SPLCVcp基因（No.AF104036.1）进行比对，序列同源性为98%，确定阳性对照质粒构建成功。

图1 SPLCV PCR产物凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of the SPLCV PCR products

2.2 SPLCV cp 基因标记引物的PCR 扩增条件的优化及结果检测

为了达到最佳的扩增效果，本研究针对带标记的引物对S-2F/S-2R 的退火温度进行梯度优化，根据凝胶电泳的效果确定最佳退火温度，电泳结果如图2 所示。对于SPLCV，61～55 ℃的扩增条带都较为清晰明亮，且未出现非特异性条带，最终选取最佳退火温度为57 ℃。

图2 退火温度梯度电泳图Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

2.3 带标记的引物对S-2F/S-2R的特异性分析

为了验证带标记的引物对S-2F/S-2R对SPLCV检测的特异性，以SPLCV 阳性样本为对照，用S-2F/S-2R扩增检测2 种甘薯DNA 病毒SPSMV-1 和SPBV-B，以及3 种甘薯RNA 病毒SPFMV、SPCSV 和SPLV。特异性检测结果表明，除了SPLCV 外，其余5种甘薯病毒均没有扩增出特异性条带（图3）。说明引物对S-2F/S-2R对SPLCV的检测具有较好的特异性。

图3 SPLCV PCR特异性检测电泳图Fig.3 Specificity analysis of SPLCV PCR detection system

2.4 层析检测系统羧基磁粒抗体包被条件的优化结果

偶联量可以直观显示出抗体分子在羧基磁粒表面的结合效率，对灵敏度的评价有实际意义［19-20］。由图4 可知，随着地高辛单克隆抗体投入量的增加，抗体偶联率逐渐降低。在偶联量方面，抗体投入量为20 µg时，纳米粒子对地高辛单克隆抗体的偶联量最高。而当抗体投入量增加为25 µg 时，其地高辛单克隆抗体的偶联量下降，推测是投入量为20 µg 时，纳米粒子表面已相对饱和而出现空间位阻的原因。因此，20 µg地高辛单克隆抗体为0.1 mg 羧基磁粒的最佳抗体标记量。

图4 抗体投入量对羧基磁粒偶联地高辛抗体的影响Fig.4 Effect of antibody amount on coupling amount when anti-Digoxin antibodies conjugate on NPs surface

2.5 阳性对照质粒的试纸条检测

用带标记的引物S-2F/S-2R 对阳性对照质粒进行扩增，取扩增产物5 µL 进行琼脂糖凝胶电泳，取扩增产物50 µL进行试纸条检测。由图5可知，在凝胶电泳检测中空白对照未出现条带，阳性对照质粒扩增后出现了296 bp 大小的目的条带。试纸条上，空白对照的检测线处（T 线）未出现条带，而阳性质控的检测线（T线）处出现显色，这与凝胶检测电泳结果相对应。说明本研究中对于SPLCV-PCR 层析检测系统的构建是有效的。

图5 阳性对照质粒PCR产物琼脂糖电泳及层析检测结果图Fig.5 PCR electrophoresis map and nucleic acid strip fast detection system of positive quality control reference

2.6 层析系统灵敏性检测

利用微量紫外分光光度计对阳性样本提取的甘薯叶片组织DNA 进行浓度测定，测定结果为25 µg·mL-1。将总DNA 分别稀释至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng·µL-1，在最适条件下进行PCR 扩增，扩增产物分别用琼脂糖电泳和层析系统进行检测。由图6可知，当DNA 浓度为0.000 1 ng·µL-1时，琼脂糖凝胶电泳结果无可见条带，而层析系统检测线仍有明显条带，表明新建立的PCR-层析试纸条检测系统比琼脂糖凝胶电泳方法灵敏度高10 倍，其最低检出限为0.000 1 ng·µL-1。

图6 核酸试纸条灵敏性检测结果图Fig.6 Sensitivity map of nucleic acid strip fast detection system

2.7 大田疑似样本检测

当对大田中采集的9 份疑似感染SPLCV 样本的DNA 进行特异性扩增后，扩增产物在层析检测系统的结果与琼脂糖电泳检测结果一致，有5 份样本检测均为阳性（图7）。扩增产物送生工测序，结果表明这5份样本中均存在SPLCV。

图7 大田采集的9份SPLCV疑似样本检测Fig.7 Detection of 9 suspected samples of SPLCV collected in the field

3 讨论

在甘薯产业中，甘薯病毒的侵染是导致甘薯品质与产量的重要因素，因此移栽薯苗前期培养脱毒甘薯苗是防治病毒的主要手段。甘薯病毒病检测的传统手段主要有症状诊断、指示植物嫁接检测［21］、血清学检测［22-23］、分子检测技术［24-25］等，这些病毒检测方法都是现阶段最常用的检测手法。症状诊断不需要使用任何仪器设备与药品，但容易漏检一些无症状的隐性病毒［26］。指示植物嫁接检测法灵敏度高，但所需时间较长。血清学法快速高效，但是该技术在制备单克隆抗体时分离单独病株较困难，且后续制备血清耗时较长，且检测时会出现假阳性反应。分子检测法现在有常规PCR 法、环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［27］、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）［28］等。传统的分子PCR 检测手段在扩增后仍需进行制胶、跑胶、成像观测等传统步骤，在大量培养脱毒薯苗，以及田间监测时，病毒检测结果观察步骤仍显繁琐、冗长，且由于凝胶上样数量的限制，同时大批量检测样品仍有困难。RPA 法仍需使用成像系统观测结果，而LAMP 虽然是可视化检测，却因为检测过程中会产生气溶胶而易出现假阳性。因此，实际生产中急需一种快速简便、结果准确的检测手段。

本研究以SPLCV 为研究对象，设计其cp基因区间的特异性引物，并在两端标记地高辛和生物素，用含有抗地高辛抗体标记的羧基磁粒和包埋有链霉亲和素的层析试纸条对PCR 产物进行检测，建立了SPLCV 快速检测的PCR-层析试纸条方法。该方法省去了传统扩增产物检测时制胶、跑胶的步骤，不需要使用凝胶成像系统，3 min左右即可肉眼判读结果。本试验通过检测9 份大田样本发现，所建立的SPLCV PCR-层析试纸条检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测的结果一致，保证了结果的可靠性。本研究将层析检测技术应用于SPLCV的检测，所选取的特异性引物是针对SPLCVcp基因区域而设计的，通过特异性检测，任何与引物不匹配的基因均无法进行核酸扩增。并且该层析检测方法灵敏度高，其最低检测限在DNA水平上可达0.000 1 ng·µL-1，灵敏度是同为可视化检测的LAMP 法的10 倍，且没有假阳性的出现。该系统具有很好的兼容性，利用相同的标记物，也可实现可视化检测，因此该系统具有很好的应用前景。

4 结论

本研究以SPLCVcp基因为目的基因序列，通过引物扩增条件及层析试纸条体系的优化，构建了SPLCV PCR-层析试纸条检测方法，该方法与琼脂糖凝胶电泳法的检测结果高度一致，但所需检测时间缩短至3 min；特异性检测结果显示，该层析检测方法具有较高的特异性；灵敏度检测结果显示，该层析检测方法的灵敏度为0.000 1 ng·µL-1基因组DNA。