鸭坦布苏病毒病的研究进展

2023-04-06郝桂英殷蓓蓓赵开强陈光芬

中国畜禽种业 2023年1期

郝桂英，陈玲，殷蓓蓓，赵开强，张其，陈光芬，宋浪

（1.西昌学院动物科学学院，四川西昌 615013；2.西昌华农禽业有限公司，四川西昌 615000）

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）隶属于黄病毒科、黄病毒属，是恩塔亚病毒群中的一种新型黄病毒，可感染鸭、鹅、鸡、鸽、麻雀、鹦鹉等，也可感染小鼠，具有潜在的公共卫生安全风险。对鸭的危害最大，主要引起蛋鸭产蛋量急剧下降、卵巢出血性坏死，雏鸭或育成鸭腹泻以及头颈震颤、站立不稳、共济失调等神经症状[1]，严重者出现死亡，是一种急性、高度接触性传染病，发病率高达100%，死亡率为5%～15%[2]，给养禽业造成巨大的经济损失，严重威胁养禽业的健康发展。该文从病原、流行病学、临床症状及病理变化、诊断和防控等方面对鸭坦布苏病毒病的最新研究进展进行综述，希望可以为该病的综合防控提供思路。

1 病原

鸭坦布苏病毒呈球形，直径40～50nm，为有囊膜单股正链RNA 病毒。基因组大小约为11kb，包含5' 端非编码区（untranslated regions，UTR，长度94nt）、1 个开放阅读框（open reading frame，ORF）和3'-UTR（618nt），5'-UTR 和3'-UTR 均高度保守，无多聚腺苷酸尾[3]。ORF 编码一个长度为3245 个氨基酸的多聚蛋白前体，通过病毒丝氨酸蛋白酶和宿主信号肽酶剪切成10 个蛋白，即3 个结构蛋白（核衣壳蛋白（caspid，C）、前膜蛋白（premembrane，PrM）、囊膜蛋白（envelope，E））和7 个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5）[4]。结构蛋白参与病毒感染时病毒粒子的吸附、膜融、组装和出芽，非结构蛋白参与病毒的入侵、复制、翻译，同时调控宿主的抗病毒天然免疫[5,6]。

DTMUV 对氯仿、乙醚、去氧胆酸钠等脂溶剂敏感；不耐热，56℃15min 即可灭活；不耐酸、碱，最适pH 为8.0～8.5；该病毒对鸡、鸭、鹅、鸽、鼠、兔、猪和人的红细胞均无凝集特性，但经蔗糖-丙酮处理后，可凝集鸡、鸭、鹅、鸽和猪的红细胞[7]。DTMUV 可以用鸡胚或鸭胚进行增殖，鸭胚上增殖效果更好；也可在细胞上传代培养，如禽源的鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞（DEF）、鸡胚成纤维细胞系（DF-1），哺乳动物源的幼仓鼠肾细胞系（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）、人胚胎肾细胞系（HEK293）、白蚊伊蚊细胞系C6/36 细胞等[8]。

根据ORF 核苷酸的遗传进化关系，将东南亚流行的坦布苏病毒分为两个谱系，即TMUV 和DTMUV。TMUV 谱系主要分离自蚊及早期东南亚地区的鸡；DTMUV 谱系分为3 个群，泰国和马来西亚等地区分离株位于1 亚群和2.1 亚群，我国分离株主要位于2.1 亚群、2.2 亚群和3 亚群，其中2013 年前的分离株聚集在2.2 亚群，近年来的大多数分离株聚集在2.1 亚群[9]。

2 流行病学

2.1 易感动物

几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括北京鸭、樱桃谷鸭、番鸭、山麻鸭、金定鸭、绍兴鸭、缙云麻鸭、龙岩鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭等，其中以蛋鸭较为易感。还能感染蛋鸡、鹅、鸽、麻雀、鹦鹉、野鸭、小鼠。鸟类尤其麻雀是DTMUV 的贮存宿主，一般不会引起发病，但在传播过程中可能起着非常重要的作用。鸭存在健康带毒状态[10]。

鸭坦布苏病毒对7 周龄以下的雏鸭具有较强致病性，其中2 周龄内的雏鸭更易感，感染率和发病率高达90%以上，死亡率5%～30%，2～4 周龄鸭死亡率高达40%，5～6 周龄鸭死亡率高达25%。对育成鸭的致病性与鸭的周龄相关，7～21 周龄均易感，其中7～10 周龄、18～21 周龄较易感，14～16 周龄有较强抵抗力[11]。7～8 周龄鸭死亡率低于10%。蛋鸭感染后日产蛋率可下降5%～20%，死亡率约为2%～5%。

2.2 传播途径

在自然条件下，DTMUV 可通过库蚊作为媒介传播病毒，因此，表现出明显的季节性[12]。但通过监测发现，该病一年四季均可发生，夏季和秋季是高发期，在冬季依然出现流行，因此该病毒还能通过消化道、呼吸道等方式传播。该病传播速度快，一般可在2d 内传遍整栏鸭群。另外，该病还可垂直传播，导致种蛋孵化率、出壳率下降，死胚及弱雏增多[13]。候鸟可能在DTMUV 跨地域传播中起重要作用。DTMUV存在跨越种间屏障传播的可能性。

1955 年首次从马来西亚吉隆坡的三带喙库蚊体内分离到坦布苏病毒，1982 年和1992 年在泰国北部蚊体内分离到；1995 年，从我国石家庄发病的康贝尔鸭肝脏、脾脏分离到疑似黄病毒科的病毒。直到2010年4 月我国鸭场开始暴发坦布苏病毒病，已在浙江、江苏、福建、安徽、江西、山东、河北、黑龙江、北京、广东、广西、重庆、上海、山西、湖南、湖北、河南、四川、贵州、云南、内蒙古等省（市）发病和流行[14]。

3 临床症状及病理变化

雏鸭、育成鸭感染后主要表现为精神沉郁、体温升高、采食量下降、拉绿色稀粪、不愿站立、驱赶不动，部分病鸭出现翻个、脚软、歪脖、双脚麻痹、步态不稳等神经症状。通常感染后4～7d 为死亡高峰，从第13 天开始逐渐好转。耐过鸭通常表现为发育不良。剖检可见各脏器均有不同程度病变，心脏肿大、出血；肺脏肿大；肝脏呈土黄色，表面有点状坏死灶或块状出血；脾大、出血、瘀血，甚至破裂，呈斑驳样大理石纹；肾脏肿大、有坏死点，偶尔有出血点；脑有不同程度水肿或呈树枝状充血。

产蛋鸭感染后的典型症状是产蛋量骤降，一般在感染后第2 天出现厌食，随后3～4d 产蛋率急剧下降，可下降至10%以下，甚至绝产，排绿色粪便。部分病鸭伴随有双脚麻痹、摇头晃脑等神经症状。病程约数周，一般可耐过，但新开产鸭表现最为严重，耐过蛋鸭的产蛋水平无法恢复至发病前。剖检可见心肌苍白，有时可见条索状坏死；肝脏发黄、肿大；脾大甚至破裂，偶见脾脏萎缩；卵巢出血性坏死，卵泡变性、萎缩、破裂，卵泡膜出血；公鸭睾丸、输精管萎缩。

种鹅感染后潜伏期一般为3～5d，主要表现为体温升高，采食量下降，产蛋量急剧下降，后期表现为头颈抽搐、翅膀麻痹、步态不稳、共济失调甚至瘫痪等神经症状，死淘率为5%～10%。耐过种鹅产蛋性能一般不能恢复到正常水平[15]。肉鹅在40～60 日龄发病，拉绿色稀便，翅和双脚麻痹，死淘率约10%。

蛋鸡感染后主要表现为产蛋量下降，通常不死亡[16]。

4 诊断

4.1 临床诊断

根据临床症状和剖检病变进行初步诊断，然后再通过病毒分离与鉴定、血清学以及分子生物学等方法进行确诊。

4.2 病毒分离与鉴定

采集发病动物的卵巢、肝脏、脾脏、脑等病变组织，经研磨、离心、过滤后接种鸡胚或鸭胚，也可用DEF、CEF、DF-1、BHK-21、Vero 等细胞系进行病毒的分离鉴定，其中，BHK-21 对DTMUV 的分离率最高[17]。但该方法对研究人员的操作技术要求较高，且成功率相对较低。

4.3 血清学诊断

目前，血清学诊断方法有血凝抑制试验（HI）、乳胶凝集试验（LAT）、琼脂扩散试验、间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析及中和试验等[18-22]。

4.3.1 血凝抑制试验（HI）

用鸡胚、鸭胚、DEF、BHK-21、Vero 细胞增殖的坦布苏病毒不能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，但用乳鼠脑组织增殖并经蔗糖-丙酮处理后可与鸡、鸭、鹅、鸽、猪的红细胞发生凝集反应，用于血凝抑制试验。Wang 等[23]建立了鸭坦布苏病毒HI 抗体检测方法。

4.3.2 乳胶凝集试验（LAT）

万春和等[24]将纯化的DTMUV WR 株制备成致敏乳胶，建立了检测抗体的乳胶凝集试验。该方法不需要特殊设备，在1～5min 内肉眼观察判定结果，具有简便、快速、特异等优点，可用于临床病例的快速诊断和血清流行病学调查。

陈浩等[25]用纯化的抗DTMUV PrM 单克隆抗体、施少华等[26]用纯化的抗DTMUV 单克隆抗体4E11 致敏乳胶，相继建立了检测鸭坦布苏病毒的乳胶凝集试验。

4.3.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 具有操作简单、快速，可同时检测大量样品的优点，在坦布苏病毒病临床检测中可广泛应用，已报道有间接ELISA、竞争ELISA 和阻断ELISA 等。

张德宝等[27]以纯化的DTMUV 奉贤株（FX2010）全病毒、施少华等[28]以纯化的DTMUV WR 株全病毒作为包被抗原，相继建立检测DTMUV 抗体的间接ELISA，具有较高的敏感性和特异性，更适宜于鸭坦布苏病毒抗体的检测。

郝明飞等[29]以纯化的DTMUV E 重组蛋白、傅秋玲等[30]以E 蛋白抗原表位区E1 蛋白、陈伟国等[31]以ZJSBL01 株E 蛋白结构域Ⅲ（EDⅢ）重组蛋白作为包被抗原，相继建立检测DTMUV 抗体的间接ELISA。

李晨曦等[19]利用DTMUV E 蛋白特异性抗原表位87YAEYI91 建立Epitope-ELISA，该方法的相对特异性和敏感度分别为100%和96%，具有特异性好、无交叉反应性，可用于DTMUV 诊断和抗体水平的评价，但该方法阳性样品的OD 值均偏低，在亲和力上还有待进一步优化提高。

谢星星等[32]以纯化的鹅源坦布苏病毒JS804 株NS1 重组蛋白、万春和等[33]以纯化的DTMUV WR 株NS1 重组蛋白、提金凤等[20]以SDSG 株NS1 重组蛋白作为包被抗原，相继建立间接NS1-ELISA。

谢星星等[34]以鹅源坦布苏病毒JS804 株制备的多克隆抗体为捕获抗体，抗鹅坦布苏病毒NS1 蛋白的单克隆抗体4A9 作为检测抗体，建立检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA。

Bai 等[35]使用单克隆抗体IF3 和3B6，建立抗原捕获ELISA（AC-ELISA）检测临床样品中的DTMUV E抗原，与RT-PCR 法相比较，AC-ELSIA 的特异性和敏感性分别为94.1%和98.0%。

Fu 等[36]以灭活的DTMUV 全病毒为包被抗原，兔抗DTMUV 阳性血清为竞争抗体、抗兔IgG-HRP 作为酶标二抗，建立固相竞争ELISA，不仅能够检测DTMUV，还能够检测来源于不同宿主血清中的DTMUV 抗体。用该方法检测44 份血清样品，并与病毒中和试验结果对比，两种方法符合率为100%。

Li 等[22]以纯化的FX2010 株全病毒作为包被抗原，单克隆抗体1F5 建立一种阻断ELISA，用于检测DTMUV 的中和抗体。

用全病毒建立的ELISA 方法存在抗原制备烦琐、每批全病毒纯度差异大、成本高等缺点，而且容易与其他黄病毒出现交叉反应；用NS1 建立的ELISA 方法不仅可用于DTMUV 早期感染的诊断，还可用于免疫后抗体水平监测；而以E 蛋白建立的ELISA 方法不能区分活毒或灭活苗的免疫。

4.3.4 胶体金免疫层析条带法（ICS）

该方法利用微孔膜的渗透和毛细作用，在固定膜上提供快速的抗原-抗体反应，不需要仪器设备，室温静置15min 即可观察结果。与其他方法相比，快速简便、成本低，可操作性强，适合临床样品的快速检测，且试纸条保存期长。

Deng 等[37]研制了检测DTMUV 抗原的胶体金快速检测试纸条和DTMUV 抗体的双抗原夹心式免疫层析试纸条。

刘艳红[38]以重组E 蛋白和羊抗鼠IgG 作为金标蛋白制备了双抗原夹心的胶体金免疫层析方法，Yu 等[21]采用E 蛋白纯化单克隆抗体A12D3 标记胶体金，以E 蛋白多克隆C12D1 抗体用作捕获抗体，用山羊抗鼠IgG 分别划线制备了DTMUV 胶体金免疫试纸条。

但目前该方法对DTMUV 感染的检测仍仅限于实验室，至今仍无商品化的胶体金试剂盒用于DTMUV及其抗体的检测。

4.4 分子生物学诊断

自DTMUV 暴发以来，已建立RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）、反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）等检测方法，其中以RT-PCR 最常见，适用于流行病学调查和诊断。

4.4.1 RT-PCR 检测技术

王建昌等[39]建立基于DTMUV E 基因、提金凤等[40]建立了基于NS1 基因、Cao 等[41]建立基于NS3 基因、Ninvilai 等[42]建立基于NS5 基因的RT-PCR 检测方法，可直接检测病料，能够达到快速检测要求。

4.4.2 RT-qPCR 检测技术

陈国强等[43]建立基于DTMUV E 基因、万春和等[44]建立了基于NS1 基因、刘青涛等[45]建立基于NS2A 基因、王巧萍等[46]建立基于NS5 基因的RT-qPCR 检测方法，可从病料中快速检测出DTMUV。实时荧光定量PCR 不仅具有灵敏度高、特异性强、花费时间少等优点，还能对病毒进行定量，但该技术需要荧光PCR 仪，对操作人员的要求较高，在基层推广受到一定限制。

4.4.3 RT-LAMP 检测技术

该技术是针对靶基因的6 个区域设计4 条特异性引物，利用链置换DNA 聚合酶在恒温条件（65℃左右）高效扩增核酸，且在水浴锅中1h 即可完成反应。肉眼直接观察结果，具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，特别适合基层早期快速检测。但该方法存在重复性较差、无法定量也难以判断是否发生非特异扩增等缺点。

韩凯凯等[47]建立了基于RT-LAMP 的鸭坦布苏病毒检测方法。

4.4.4 纳米PCR 检测技术

Wanzhe 等[48]建立一种以DTMUV E 基因为靶点的纳米PCR 方法，其检测限为1.8×102拷贝/μL，具有较高的特异性和敏感性，对临床标本中DTMUV 的快速检测具有潜在的应用价值。

5 防控

5.1 疫苗免疫

疫苗免疫是预防和控制鸭坦布苏病毒病最有效的措施之一，目前商品化的疫苗主要有鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB 株）、鸭坦布苏病毒病活疫苗（WF100株、FX2010-180P 株）。同时基因重组疫苗、DNA 疫苗、亚单位疫苗等也是目前研究的重点。用杆状病毒表达系统构建的截短的E 蛋白能诱导雏鸭产生特异性抗体，有望成为预防雏鸭感染的潜在候选疫苗[49]；E蛋白融合表位蛋白rTBE 具有免疫原性及保护力，有望作为一种安全有效的新型DTMUV 候选亚单位疫苗[50]。用腺病毒和沙门氏菌作为载体开发DTMUV 重组载体疫苗，可刺激机体产生较高水平的细胞免疫应答，并产生高水平的中和抗体，能产生100%的攻毒保护作用[51]。重组塞姆利基森林病毒（SFV）复制子在DEF细胞中可高度表达E 蛋白，用这种DNA 疫苗肌肉注射雏鸭后，能产生较强的体液和细胞免疫反应，并能抵抗AH-F10 强毒株[52]。重组融合肽Tα1-BP5 能显著增强机体免疫应答水平，对DTMUV 灭活疫苗有免疫增强作用[53]。DTMUV 灭活疫苗与胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）、白介素2（IL-2）联用，能增强机体的体液和细胞免疫应答，因此pUC18-CpG、IL-2 可作为DTMUV 灭活疫苗的佐剂[54,55]。

通过对DTMUV 分离株全基因组序列分析发现，DTMUV 具有高度遗传多样性，而现行的灭活疫苗、弱毒疫苗对所有分离株是否均具有免疫保护力还未知，需要进一步的研究。

5.2 对症治疗，控制疫情传播

目前尚没有药物对黄病毒病有很好的治疗效果，可使用抗病毒药物（如金刚烷胺、利巴韦林等）治疗DTMUV 感染，或使用清热解毒中草药（如清瘟败毒散、双黄连、板蓝根、金银花、白术等）和干扰素。EGCG（存在于绿茶中的多酚）、石蒜碱，在感染雏鸭中有抗DTMUV 功效[56]。同时添加氨苄西林、硫酸阿米卡星、林可霉素、盐酸恩诺沙星等抗生素类药物防止细菌病继发感染。在发病早期，可采用卵黄抗体对健康鸭进行紧急接种，用2 倍使用剂量对发病鸭进行紧急治疗。

5.3 其他生物安全措施

在日常养殖工作中必须做好驱蚊、灭蚊、灭鼠、驱逐麻雀等工作，同时保持环境清洁卫生，污水、垃圾以及卫生死角等要及时清除，减少蚊虫滋生；加强饲养管理，对圈舍、料盘、饮水器和周围环境等定期消毒；注意通风，对病死禽进行生物安全处理；在日粮中添加复合维生素和微量元素，提高禽群的免疫力和抵抗力。由于DTMUV 可感染鸡、鸭、鹅，应避免不同禽类的混养。