刘云岫，尚勤旺，韩紫硕，徐晓厚，王德亚*

(1.枣庄学院生命科学学院/枣庄市樱桃病毒病快速诊断与绿色防控技术创新中心，山东枣庄 277160；2.山东省龙口市现代果树技术研究所，山东龙口 265718)

病毒病是樱桃的一种重要病害，其危害严重性和持久性在生产中逐年显现，已成为影响樱桃产业健康发展的关键因素之一[1-3]。樱桃小果病毒1(Little cherry virus 1, LChV-1)在中国大部分樱桃产区均有分布，侵染可引起果实变小、晚熟等，严重影响了产量与质量[4, 5]。LChV-1为长线形病毒科(Closteroviridae)隐症病毒属(Velarivirus)，2004年波兰首次报道发现 LChV-1，该病毒主要通过昆虫介体等途径传播[6-8]。LChV-1基因组是一条(+)ssRNA，大小约17 000 nt。LChV-1的检测方法主要有RT-PCR、Q-PCR和免疫电镜法。其中PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点，但存在仪器昂贵，操作技术难度大等问题，难以在生产实际中推广应用。环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是采用4条特异引物和DNA链置换聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下建立的一种分子检测技术，已广泛应用于病毒病害的分子检测。笔者针对LChV-1建立特异、快速的检测方法，为樱桃小果病的田间快速检测应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、载体和菌种

健康的以及感染了LChV-1的甜樱桃叶片样品均保存于枣庄学院病毒基因工程泰山学者工作站(图1)。大肠杆菌DH5α菌株购自索莱宝公司，pMD18-T载体购自TaKaRa公司。pEHISTEV表达载体，BL21(DE3)Rosetta感受态细胞等由本实验室保存。引物合成和核酸序列测定由上海生工生物工程股份有限公司进行。

1.2 RT-LAMP引物合成和筛选

取100 mg待测的甜樱桃叶片，按照植物RNA提取试剂盒(北京天根)的说明书提取样品的总RNA，保存于-80 ℃保存备用。根据NCBI数据库登录的LChV-1 CP基因序列(KR736335)，利用APE软件设计检测引物；利用LAMP引物设计软件primer explorer 4.0(http：//primerexplorer.jp/e/index.html)设计3组特异性引物序列(表1)。

图1 采集的疑似病毒病樱桃叶片

1.3 RT-PCR检测

RT-PCR在本研究中用于LChV-1的检测，反应体系为：以 1.0 μg植物总RNA，4.0 μL反向引物和2.0 μL dNTP，85 ℃变性处理5 min，冰上放置3 min，然后加入5.0 μL 5×MLV buffer，0.5 μL RRI，1.0 μL反转录酶(Takara)，dd H2O补齐25.0 μL体系，42 ℃反应90 min，后置冰上5 min，进行下步PCR反应。

1.4 RT-LAMP反应条件的优化

反应温度设置为56、57、59、61和63 ℃，引物浓度比为 4∶1、6∶1和8∶1。根据试验结果筛选出RT-LAMP的反应温度等最佳组合。

1.5 产物鉴定

将反应产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取大小200 bp左右的条带，用胶回收试剂盒回收目标片段连接于pMD18-T载体。选取阳性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP 引物设计及筛选

分别设计针对LChV-1的1组检测引物以及3组RT-LAMP引物(表1)。提取疑似感染LChV-1的甜樱桃叶片总RNA(图2-A)，利用的特异性引物(LC-12 430-F和LC-12 960-R)进行RT-PCR检测，用来扩增LChV-1基因组12 430～12 960间约530 bp片段(图2-B)。经测序鉴定，样品中存在LChV-1。

表1 樱桃小果病毒1的RT-PCR和RT-LAMP检测用引物序列

图2 病叶总RNA提取(A)和PCR扩增LChV-1片段电泳图(B)

通过分析3组RT-LAMP引物的Tm值、位置及长度等信息，以F3-3/B3-3 和FIP3-3/BIP3-3 为候选引物。加入RT-LAMP体系，空白水作为阴性对照，经2%琼脂糖凝胶检测表明：以F3-3/B3-3 和FIP3-3/BIP3-3为引物可以扩增出现梯状目的条带(图3)。切取200 bp左右的条带进行克隆，测序结果显示所克隆的片段大小为212 bp。在NCBI数据库中进行序列比对结果表明，其与LChV-1分离物(KR736335)的核苷酸同源性为97.6%，说明获得的序列为LChV-1的基因组序列。

图3 LAMP检测LChV-1的引物筛选

2.2 RT-LAMP反应条件及体系的优化

分别对RT-LAMP的反应体系反应中的温度、引物浓度比等进行优化。结果表明，RT-LAMP在56～63 ℃均有扩增，57 ℃条件下扩增60 min，条带呈明显的阶梯状且在100～200 bp左右(图4-A)。设置内外引物浓度之比为4∶1、6∶1、8∶1，结果表明：当引物浓度之比为4∶1时，基本没有条带扩增，当引物浓度之比为6∶1和8∶1时，条带清晰，但随着内外引物浓度的提高，产出量没有明显的增加，因此选择6∶1为最适引物浓度比(图4-B)。Mg2+梯度实验表明：Mg2+浓度在2.0～8.0 mM时，均可以扩增出条带。当Mg2+浓度达在6.0 mM时，扩增条带最亮且最清晰(图4-C)。

图4 LChV-1 RT-LAMP反应最佳温度、Mg2+浓度和内外引物比的筛选

2.3 RT-LAMP检测技术的应用

运用 RT-LAMP法对从枣庄、泰安、烟台和临沂采集的35份疑似樱桃小果病的样品进行检测，结果显示有13份检测到LChV-1，且RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致(表 2)

表2 甜樱桃病害样品检测

3 小结与讨论

目前，国内已报道侵染甜樱桃的病毒病有14种，其中樱桃病毒A(CVA)发病率最高，接近70%[5, 9]，而樱桃小果病毒1(LChV-1)和樱桃小果病毒2(LChV-2)，发病率较低，侵染可引起果实变小、晚熟等，且一旦侵染终身带毒，严重影响了产量，给甜樱桃种植者带来较大的经济损失。

通过对LChV-1的CP序列进行分析，设计了3组特异性引物，经优化，筛选获得1组特异性引物。经过筛选和反应体系的优化，建立了用于检测LChV-1的RT-LAMP的检测体系，具体为：6.0 mM Mg2+,0.2 μM的外引物和1.2 μM的内引物，在57 ℃条件下反应60 min。该方法仅需1台水浴锅在60 min内就可完成反应，而RT-PCR不仅需要昂贵的PCR仪器，而且反应时间为2 h左右。具有简单、方便、快捷的特点，适合基层检测人员的使用。