高渐联，周 霖，王肖辉，聂兴国，朱超男

基于液质联用结合网络药理学的复方伤痛胶囊中5种药效成分定量及作用机制研究

高渐联1，周 霖2*，王肖辉2*，聂兴国3，朱超男1

1. 新乡医学院第一附属医院 药学部，河南 卫辉 453100 2. 郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450052 3. 新乡医学院第一附属医院 骨科，河南 卫辉 453100

对复方伤痛胶囊中的5种药效成分进行定量，提升药物质量标准，并对药效成分在药物治疗中的作用机制进行研究。采用Acquity UPLC®BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）进行成分初步分离，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱；采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS仪器，使用Full mass/dd MS2模式对药物中的关键成分进行快速、准确含量测定；基于网络药理学构建关键成分-重要靶点网络，并进一步进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本体（gene ontology，GO）分析，找到关键信号通路和作用靶点。建立的分析方法学较为稳定，能够满足分析的标准需要；5种药效成分（没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚和延胡索乙素）线性关系均良好，≥0.999 0；网络药理学结果显示，药物中的药效成分可能是通过基质金属蛋白酶9（matrix metallo protein 9，MMP9）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、MMP2、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等炎症、疼痛关键靶点，从而发挥缓解疼痛及炎症等作用。实验验证结果发现，没食子酸能够明显降低脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病RAW264.7细胞中的IL-2水平，大黄素能够明显降低RAW264.7细胞中的PTGS2水平，大黄酸能够明显降低RAW264.7细胞中的MMP9水平，大黄素甲醚能够明显降低RAW264.7细胞中的EGFR水平，延胡索乙素能够明显降低RAW264.7细胞中的MMP2水平。对复方伤痛胶囊的质量提升提供了重要的参考依据，同时为中医药相关药效成分研究提供了一种借鉴思路。

网络药理学；复方伤痛胶囊；没食子酸；大黄素；大黄酸；大黄素甲醚；延胡索乙素；基质金属蛋白酶9；前列腺素内过氧化物合酶2；白细胞介素-2；表皮生长因子受体；核因子-κB；转化生长因子-β；肿瘤坏死因子

复方伤痛胶囊（Fufang Shangtong Capsule，FSC）是由大黄（酒制）、当归、柴胡、天花粉、桃仁（去皮）、红花、醋延胡索、甘草等中药材，在中医药理论的指导下，经现代工艺提取加工而成的中药复方制剂[1]，具有化瘀、行气、止痛的功效，临床上常用于急性胸壁扭挫伤之瘀滞证等，疗效确切，应用广泛[2-4]。药效成分是药物中的关键物质，也是药物发挥治疗疾病作用的根本基础。本研究查阅文献并采用网络药理学方法对FSC中的成分进行筛选，发现其中的没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚和延胡索乙素在疼痛以及炎症性疾病治疗中发挥着关键作用，是FSC的潜在重要药效成分[5-7]。由于药物中的有效成分含量较低，且目前尚未有对该药物中此类成分定量研究的相关报道。因此，本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS高分辨液质联用系统，建立了快速、科学、准确的一级Full mass全扫描同时定性、定量分析方法对FSC中的5种药效成分进行含量测定。该方法具有分析时间短、选择性强、灵敏度高等优点，可用于FSC中复杂活性成分的快速定性及定量分析。同时，本研究基于网络药理学及实验药理学对以上成分的关键作用靶点进行系统分析，深入挖掘其在药物治疗疾病中的作用。

1 仪器与材料

Q-Exactive型液相色谱-质谱联用系统，美国Thermo Fisher Scientific公司；Acquity UPLC®BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美国Waters公司；New Classic MS型十万分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo上海有限公司；BX7200HP型台式超声波清洗器，上海新苗医疗器械制造有限公司。

对照品没食子酸（批号MUST-18032801）、延胡索乙素（批号MUST-17022720），购于成都曼思特生物科技有限公司；对照品大黄酸（批号wkq16062204）、大黄素（批号wkq16071004）、大黄素甲醚（批号wkq16070403），购于四川维克奇生物科技有限公司；质量分数均大于99%。甲酸、乙腈、甲醇为色谱级纯，美国Fisher公司；水为哇哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为分析纯。

RAW264.7细胞（批号CL0173）购自普诺赛生物科技有限公司；胎牛血清（批号BL205C）、DMEM培养基（批号A8190R）、SDS-PAGE（批号BL502B）、ECL试剂盒（批号GK10008）购自河南天驰生物技术有限公司；基质金属蛋白酶9（matrix metallo protein 9，MMP9，批号ab100610）、MMP2（批号ab100606）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2，批号ab221834）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2，批号ab278922）及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，批号ab269558）ELISA试剂盒购自Abcam生物科技有限公司。

一抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH，批号GB15002）、MMP9（批号GB11132）、IL-2（批号GB11114）、PTGS2（批号GB11077-2）、MMP2（批号GB111507）、EGFR（批号GB111504）；二抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-山羊抗小鼠（批号GB23301）、HRP-山羊抗兔（批号GB23303）试剂盒均购自Servicebio生物科技有限公司。

FSC编号为S1～S20，批次分别为805031、806038、805076、810002、805074、808031、806053、809031、807073、803022、811003、805038、805019、809020、807018、806064、803038、808020、807067、807070，均购自甘肃省西峰制药有限公司，密封保存于阴凉干燥处。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的配制

精密称定适量的没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚和延胡索乙素的对照品，加入纯甲醇制备成混合对照品储备液，各成分质量浓度分别为19.52、278.68、1.61、39.41、1.46 μg/mL。

2.2 供试品溶液的制备

取FSC内容物，置于锥形瓶中加入纯甲醇50 mL，密封，称定总质量，超声辅助溶解20 min（参数设置为200 W、50 kHz），放冷，再次称定质量，用纯甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，经0.22 μm微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Acquity UPLC®BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序为0～1.0 min，5%乙腈；1.0～3.0 min，5%～20%乙腈；3.0～6.0 min，20%～30%乙腈；6.0～9.0 min，30～50%乙腈；9.0～12.0 min，50%～30%乙腈；12.0～18.0 min，30%～0乙腈；18.0～20.0 min，0～5%乙腈。体积流量为0.3 mL/min；进样量为5 μL；柱温为40 ℃。

2.4 质谱条件

离子源为HESI（heated ESI）源，离子传输管温度为320 ℃，辅助气温度为300 ℃，辅助气体积流量为10 μL/min；正离子模式下：鞘气体积流量为40 μL/min，喷雾电压为3.50 kV；负离子模式下：鞘气体积流量为38 μL/min，喷雾电压为2.80 kV，/扫描范围为80～1200，一级扫描分辨率为70 000。在优化的色谱质谱条件下5种待测成分的提取离子流图及质谱图见图1，目标分析物参数见表1。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 取“2.1”项下混合对照品溶液、“2.2”项下供试品溶液和空白对照溶液（甲醇），按“2.3”及“2.4”项下色谱及质谱条件进样测定。结果显示，空白溶液对所测成分无干扰，且供试品溶液中5种待测成分的出峰时间与对照品溶液中的基本一致，说明方法专属性较好。

1-没食子酸 2-大黄素 3-大黄酸 4-大黄素甲醚 5-延胡索乙素

表1 5种待测成分的质谱分析参数

2.5.2 线性关系考察 分别精密量取混合对照品储备液适量，纯甲醇稀释并定容，依次配制成6个质量浓度的系列梯度溶液，其中没食子酸0.61、1.22、2.44、4.88、9.76、19.52 μg/mL；大黄素8.71、17.42、34.83、69.67、139.34、278.68 μg/mL；大黄酸0.05、0.10、0.20、0.40、0.81、1.61 μg/mL；大黄素甲醚1.23、2.46、4.93、9.85、19.71、39.41 μg/mL；延胡索乙素0.05、0.09、0.18、0.36、0.73、1.46 μg/mL在“2.3”和“2.4”项下UHPLC-Q-Orbitrap HRMS色谱、质谱条件进样分析，记录峰面积。以各待测物的质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），绘制标准曲线，得回归方程、相关系数（）及线性范围；以信噪比为10计算定量限，结果分别为没食子酸＝4.25×108＋8.00×107，＝0.999 8，线性范围0.61～19.52 μg/mL，定量限0.130 ng/mL；大黄素＝2.40×107－1.20×106，＝0.999 0，线性范围8.71～278.68 μg/mL，定量限1.505 ng/mL；大黄酸＝2.04×109＋3.49×107，＝0.999 4，线性范围0.05～1.61 μg/mL，定量限0.020 ng/mL；大黄素甲醚＝3.68×106－2.78×106，＝0.999 0，线性范围1.23～39.41 μg/mL，定量限1.945 ng/mL；延胡索乙素＝4.82×109＋1.27×108，＝0.999 5，线性范围0.05～1.46 μg/mL，定量限0.033 ng/mL。结果表明，5种待测化合物在质量浓度范围内线性关系均良好，≥0.999 0。

2.5.3 精密度考察 精密吸取供试品溶液（批号806038）5 μL，连续进样6次，结果显示没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、延胡索乙素的峰面积的RSD分别为1.40%、1.32%、2.22%、4.15%、1.64%，结果表明该方法精密度良好。

2.5.4 重复性考察 取同一批样品（批号806038），按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样测定并计算含量，测得没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、延胡索乙素的平均质量分数分别为237.72、4128.27、10.74、886.53、8.85 μg/g，RSD分别为0.68%、1.40%、0.87%、1.28%、0.66%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号806038），分别于0、2、6、10、12、24 h进样分析，测得没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、延胡索乙素的峰面积的RSD分别为1.08%、1.86%、1.26%、0.83%、0.68%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.6 加样回收率试验 称取样品粉末（批号806038）共9等份，每3份为1组，精密称定，分别加入没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、延胡索乙素的对照品适量，使加入各成分含量分别为FSC中相应成分含量的50%、100%、150%。按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，处理后分别进样测定。计算各待测物的平均回收率及RSD，结果显示没食子酸、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、延胡索乙素的平均回收率分别为99.75%、98.84%、100.12%、99.56%、99.16%，RSD分别1.81%、0.62%、1.46%、0.62%、0.57%，结果表明该方法下5种待测成分的测定准确度较好。

2.5.7 样品含量测定 取20个不同批次的FSC，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液各3份，在“2.3”和“2.4”项下色谱、质谱条件进样分析，记录峰面积并计算5种待测物在FSC中的含量，结果见表2。

2.6 关键药效成分的网络药理学分析及分子对接实验

2.6.1 作用靶点获取 结合PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/，数据库靶点筛选物种为人，Fit值＞2）、Swiss Target Prediction数据库［http://www.swisstargetprediction.ch/，数据库选择物种为人，靶点选择概率（probability）＞0］和Similarity Ensemble Approach（SEA）数据库（https://sea.bkslab.org/，数据库靶点筛选物种为人）3个权威网站预测5种定量成分的作用靶点，共获得593个作用靶点。

表2 FSC中5种待测成分的测定结果(, n = 20)

2.6.2 成分-靶点网络的构建 基于Cytoscape 3.9.1软件构建以上关键药效成分的成分-靶点相互作用网络图，该网络包含433个节点和593条边，如图2所示。分析网络图，以度（degree）值为中位数2倍为筛选条件，获得73个关键作用靶点；频率较高的靶点基因分别是MMP9、PTGS2、MMP2、IL-2、EGFR、丝裂原激活蛋白激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator- activated receptor γ，PPARγ）等，这些基因与免疫炎症、疼痛以及血管调节等密切相关。

2.6.3 KEGG信号通路及GO生物过程富集分析将筛选到的73个关键作用靶点导入DAVID数据库进行KEGG富集分析，以＜0.05为筛选条件，共得到44条通路，排名靠前的20条重要通路，分别为核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-17、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis）、Toll样受体（Toll-like receptor）和MAPK信号通路等，结果见图3。由此可见，在药物成分对应的靶基因下，富集的信号通路主要集中在对炎症性信号通路等方面，这些炎性信号与疼痛疾病密切相关，与FSC的主治疾病契合度较高，表明了本研究对这些药效成分定量的科学性和合理性。

图2 5种主要成分-靶点网络图

基于DAVID数据库对筛选出来的73个关键作用靶点分别从生物过程、细胞组分及分子功能3个层面进行注释，即GO生物学过程富集分析。GO富集分析结果显示，这些关键作用靶点主要富集在264个生物学过程，69种细胞组分和60种分子功能。主要生物过程富集结果见图4，分子功能及细胞组分富集分别见图5和图6。由图中GO分析结果可见，以上药效成分的生物过程主要涉及炎症反应、细胞分化以及免疫应答等；在分子功能中与生长因子活性、凝血酶活性以及能量活性等高度相关；这些靶点在细胞组分中与胞质、胞膜以及胞核等相关性较大。

图3 经KEGG富集分析后的主要通路

2.6.4 分子对接实验 首先，从RCSB PDB在线平台（http://www.rcsb.org/）导出与关键靶点相关的3D蛋白结构并导出为PDB格式。然后，从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性化合物的3D结构，以SDF格式存储。随后导入OpenBabel 3.1.1软件转化为AutoDock可以识别的格式。使用Pymol对活性化合物和蛋白结构进行去水，去除小分子的操作，并导入AutoDockTools-1.5.7软件将活性化合物设置为配体（加全氢、检测设置扭转健），蛋白结构设置为受体（加全氢），同时转换为“pdbqt”格式；运行AutoDock4（设置对接Box、对接参数、运算方法等）进行分子对接，对接结果在Pymol上进行可视化。最后，利用对接结合能来评估化合物小分子与疾病靶蛋白结合的能力。

图4 关键作用靶点的生物过程GO分析(生物过程)

图5 关键作用靶点的分子功能GO分析(分子功能)

图6 关键作用靶点的细胞组成GO分析(细胞组分)

分子对接结果（图7）显示，大黄酸对接MMP9、没食子酸对接IL-2、大黄素对接PTGS2、延胡索乙素对接MMP2、大黄素甲醚对接EGFR的结合能较低，分子对蛋白质之间至少形成2个氢键，对接结果较为稳定。

2.7 实验验证

2.7.1 细胞培养 将小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）采用含10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素以及0.08 mg/mL链霉素的DMEM完全培养液，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养，用细胞刮刀刮取细胞进行传代。

图7 药效成分与关键靶点的分子对接结果

2.7.2 ELISA法检测细胞上清液中MMP-9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR水平 本研究依据相关参考文献[8-12]并采用MTT法确定了各成分作用于细胞的最佳剂量，进一步进行实验验证。取对数生长期细胞，按照每孔2×105的密度接种于6孔板，培养24 h后，弃上清液，分别进行大黄酸（设置对照组、模型组和大黄酸6、12、24 μmol/L）、没食子酸（设置对照组、模型组和没食子酸5、10、25 μg/mL）、大黄素（设置对照组、模型组和大黄素40、80、160 μmol/L）、延胡索乙素（设置对照组、模型组和延胡索乙素5、10、20 μmol/L）、大黄素甲醚（设置对照组、模型组和大黄素甲醚2、4、6 μmol/L）的药效实验。其中对照组仅给予培养基，模型组给予1 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），各成分低、中、高剂量组在给予1 μg/mL LPS的基础上，同时添加相应浓度的药物。药物干预24 h后，取细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测各组的MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR水平。检测结果（表3～7）显示，大黄酸能够明显降低细胞上清中的MMP9水平（＜0.05），没食子酸能够明显降低细胞上清中的IL-2水平（＜0.05），大黄素能够明显降低细胞上清中的PTGS2水平（＜0.05），延胡索乙素能够明显降低细胞上清中的MMP2水平（＜0.05），大黄素甲醚能够明显降低细胞上清中的EGFR水平（＜0.05）。

表3 大黄酸对细胞上清液中MMP9水平的影响(, n = 6)

与对照组比较：*＜0.05；与模型组比较：#＜0.05，下表同

*< 0.05control group;#< 0.05model group, same as below tables

表4 没食子酸对细胞上清液中IL-2水平的影响(, n = 6)

表5 大黄素对细胞上清液中PTGS2水平的影响(, n = 6)

表6 延胡索乙素对细胞上清液中MMP2水平的影响(, n = 6)

表7 大黄素甲醚对细胞上清液中EGFR水平的影响(, n = 6)

2.7.3 蛋白印迹法（Western blotting）检测细胞中MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR蛋白表达水平 按照“2.7.2”项下方法处理并收集细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min后，于4 ℃、12 000 r/min条件下离心（半径8.5 cm）30 min，二喹啉甲酸（bicin choninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，加入适量上样缓冲液，沸水浴中处理8 min进行变性。蛋白（上样量为30 μg）经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝胶电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗（稀释比1∶2000）4 ℃孵育过夜，用添加聚山梨酯-20的Tris-缓冲盐（tris-buffered saline tween，TBST）洗膜4次，孵育二抗（稀释比1∶5000），增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）化学发光法进行显色，GAPDH作为内参。检测结果（图8和表8～12）显示，大黄酸能够明显降低细胞中的MMP9蛋白表达水平，没食子酸能够明显降低细胞中的IL-2蛋白表达水平（＜0.05），大黄素能够明显降低细胞中的PTGS2蛋白表达水平（＜0.05），延胡索乙素能够明显降低细胞中的MMP2蛋白表达水平（＜0.05），大黄素甲醚能够明显降低细胞中的EGFR蛋白表达水平（＜0.05）。

图8 各组细胞中MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR蛋白表达检测

表8 大黄酸对细胞中MMP9蛋白表达水平的影响(, n = 6)

表9 没食子酸对细胞中IL-2蛋白表达水平的影响(, n = 6)

3 讨论

3.1 提取方法优化

本实验考察了不同的提取溶剂（乙醇、甲醇、80%乙醇、80%甲醇、40%乙醇、40%甲醇、水）及提取时间（10、20、30 min）对提取效果的影响。结果发现，乙醇、甲醇均具有最好的提取效果，但使用甲醇提取后各成分的出峰效果最好，因此采用纯甲醇作为提取溶剂；提取时间设置为10 min时，待测成分提取不够完全，影响分析效果，提取时间设置为30 min时的提取效率与20 min大体相同，表明20 min时药物中的待测目标成分已经提取完全，因此本实验采用的提取时间为20 min；本实验分别使用纯甲醇30、50、70 mL提取20 min，结果发现待测成分在30 mL溶剂中提取不够完全，50 mL和70 mL的提取效率较为接近，表明待测成分在50 mL溶剂中可以提取完全，故本实验使用纯甲醇50 mL超声提取20 min。

表10 大黄素对细胞中PTGS2蛋白表达水平的影响(, n = 6)

表11 延胡索乙素对细胞中MMP2蛋白表达水平的影响(, n = 6)

表12 大黄素甲醚对细胞中EGFR蛋白表达水平的影响(, n = 6)

3.2 流动相的选择

本实验分别考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相系统的分离能力，结果发现乙腈的洗脱能力相对甲醇较强，各化合物的分离效果较好；而加入0.1%甲酸水可以使各成分响应更高，能够更好地满足分析要求。因此，本实验最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行洗脱，达到有效分离的目的。

3.3 实验药理学研究分析

本研究基于FSC中关键药效成分进行了网络药理学分析及实验药理学验证，以期能够更加深刻理解该药物药效成分对药物治疗疾病的关键作用。研究结果显示药物中的5种药效成分能够有效干预MMP9、PTGS2、MMP2、IL2、EGFR等炎症、血管因子关键靶点，表明本研究筛选到的药效成分在药物的治疗过程中起到了重要作用。在以上筛选的关键靶点及通路中，MMP2及MMP9可作用于各种胶原、明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等，可能是发挥斑块溶解进而发挥祛瘀作用的主要靶点[13]。PTGS2是非甾体抗炎药物靶标，可控制前列腺素合成，有效控制炎性反应，进而减轻疼痛[14]。IL-2在中枢和外周有镇痛作用，可能是药物发挥镇痛作用的关键靶点[15]。EGFR可以诱导并维持不同条件下的痛敏反应，其介导的信号通路对神经病理性疼痛的发生发展具有重要作用[16]。

有研究发现，通过抑制NF-κB信号通路，可以抑制炎症因子释放，从而缓解炎症性疼痛[17]；TGF-β信号在造血的发生和发育中起着关键作用，可能是活血化瘀的重要信号通路之一[18]；TNF-α通过调控NF-κB等相关信号通路，导致了进行性加重的疼痛，并进一步作用于神经元，通过P物质等在神经元间产生痛觉敏化，最终传入脊髓中枢导致剧烈的癌痛，因此，TNF信号通路也是缓解疼痛的重要通路之一[19]。

此外，有研究表明，没食子酸对小鼠促炎因子（TNF-α、IL-6）以及过敏介质组胺具有显著的抑制作用，能抑制炎症过敏反应的发生，对于疼痛疾病具有较好的缓解作用[20-21]；大黄酸可减少IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子的生成，同时抑制NF-κB和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症因子途径，显著减少免疫细胞迁移而发挥强大的抗炎作用，还能抑制MMP2及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAkt）/ Akt比值的增加而减轻炎性反应，与调节疼痛等疾病密切相关[22-23]；大黄素可通过调节鞘脂代谢及精氨酸生物合成发挥镇痛作用[24-25]；大黄素甲醚可通过调节沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信号通路来缓解机体炎症水平[26]；延胡索乙素具有显著的镇痛作用，是FSC缓解疼痛的主要药效物质之一[27-28]。以上药效成分在药物治疗疼痛性疾病的过程中从不同角度发挥着抗炎、缓解疼痛等治疗作用。

本研究采用先进的液质联用技术对药物中的关键药效成分进行了快速、准确、科学的定量，为药物质量标准的制定和提升奠定了扎实的前期基础；同时，基于网络药理学和实验药理学全面、系统地揭示了药效成分在药物质量和治疗方面的科学内涵，有助于更加直观地认识药效成分在药物中扮演的重要角色。本研究将为FSC质量水平的提升提供参考依据，同时为中医药今后相关药物药效成分研究方法提供了一种新的借鉴思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Quantitative analysis and mechanism research of five pharmacodynamic components in Fufang Shangtong Capsule based on liquid mass spectrometry combined with network pharmacology

GAO Jian-lian1, ZHOU Lin2, WANG Xiao-hui2, NIE Xing-guo3, ZHU Chao-nan1

1. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 3. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China

To accurately quantify the five pharmacodynamic components in Fufang Shangtong Capsule (复方伤痛胶囊, FSC), improve drug quality standards, and analyze the important role of pharmacodynamic components in drug therapy.An Acquity UPLC®BEH C18column (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used to separate the components. Acetonitrile-0.1% formic acid water was used as mobile phase gradient elution. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and Full Mass/dd MS2 model were used for rapid and accurate content determination of key ingredients in the drug. Key components-important target network was constructed based on network pharmacology, and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene ontology (GO) analysis was further conducted to find key signaling pathways and action targets.The analytical methodology established in this study was robust and could meet the standard requirements of analysis. All the five pharmacodynamic components had good linearity in the range of mass concentration,≥ 0.999 0. Network pharmacology results showed that the pharmacodynamic components in drugs may be key targets of inflammation and vascular factors such as matrix metallo protein 9 (MMP9), prostaglandin endoperoxide synthase 2 (PTGS2), MMP2, interleukin-2 (IL-2), epidermal growth factor receptor (EGFR). As a result, it maps to nuclear factor-κB (NF-κB), transforming growth factor-β (TGF-β), tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway inflammatory pathways, which has important reference value in drug quality and efficacy. The experimental results showed that gallic acid could significantly reduce the level of IL-2 in LPS induced RAW264.7 cells, emodin could significantly reduce the level of PTGS2 in cells, rhein could significantly reduce the level of MMP9 in cells, emodin methyl ether could significantly reduce the level of EGFR in cells, and fumarine ethyl rhizoma could significantly reduce the level of MMP2 in cells.This study provides an important reference for the quality improvement of FSC, and also provides a reference for the study of relevant TCM pharmacodynamic components.

network pharmacology; Fufang Shangtong Capsule; gallic acid; emodin; rhein; emodin methyl ether; tetrahydropalmatine; matrix metallo protein 9; prostaglandin endoperoxide synthase 2; interleukin-2; epidermal growth factor receptor; nuclear factor-κB; transforming growth factor-β; tumor necrosis factor

R283.6

A

0253 - 2670(2023)06 - 1793 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.011

2022-08-06

北京医卫健康公益基金会（TM19004）；河南省医学攻关计划（LHGJ20200524）；河南省科技攻关计划（21210231107）

高渐联，男，主管药师，研究方向为临床药学、药物分析。E-mail: gaolian2007@163.com

周 霖，男，主管药师，研究方向为药物分析、中药药理学。E-mail: 524734490@qq.com

王肖辉，女，主治医师，研究方向为药理学。E-mail: xhhyykl@126.com

[责任编辑 郑礼胜]