刘介坤，史锋厚，管 军，张 磊，3，蔡绍刚，3，刘 蕾，3，沈永宝

（1.南京林业大学 a.林学院；b.国家林业和草原局南方林木种子检验中心；c.南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.新沂市马陵山林场有限公司，江苏 徐州 221400；3.新沂市国有公益林场，江苏 徐州 221400；4.盐城市大丰区白驹镇综合服务中心，江苏 盐城 224134）

土壤盐渍化影响着植物的生长发育，是当前最为紧迫的生态问题之一[1-2]。祁琳等[3]研究发现，土壤含盐量与刺槐Robinia pseudoacacia相对高生长速率、相对地径生长速率呈显著负相关，土壤盐胁迫严重抑制了刺槐幼苗的生长。张若溪等[4]对栾树Koelreuteria paniculata的研究发现，不同混合盐胁迫对栾树生长有着不同的影响，混合盐浓度越高，栾树叶长与叶宽的生长量越低。李燕[5]的研究也表明，盐胁迫下5种杂交桑Morus alba种质幼苗的株高、生物量和生长发育状况等都受到了不同程度的抑制。

植物在不断适应盐渍化环境的同时也逐渐改变着其生长环境，对盐渍化土壤的改善与恢复起着积极的作用。研究发现，芦苇Phragmites australis[6]、碱茅Puccinellia distans、紫花苜蓿Medicago sativa、老芒麦Elymus sibiricus、扁穗冰草Agropyron cristatum[7]等均可明显改良土壤理化性质，改善土壤养分，促进土壤脱盐。但目前在江苏滨海地区，土质与生物环境较差，耐盐的经济与观赏树种尤为缺少。因此，选育兼具耐盐性、观赏性与经济价值的木本植物并进行有效栽培，将有利于滨海地区生态环境的改善与土壤资源的合理利用。

小叶栎Quercus cheniiNakai为壳斗科Fagaceae栎属Quercus落叶乔木，是中国特有的落叶栎类[8]，其树姿雄伟壮丽、根系发达、萌芽力强、木材密度大且抗压强度高，是优良的水土保持和硬质用材树种[9]，具有较高的生态、观赏与经济价值。然而作为华东地区植物区系代表树种[10]，小叶栎并没有得到充分的开发与利用，对其逆境抗性生理的研究尚未见报道。因此，本研究对小叶栎苗木进行不同浓度的NaCl胁迫处理，探究其对NaCl胁迫的生长及生理响应机制，以期为小叶栎苗木在江苏滨海地区推广种植提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为江苏省新沂市马陵山小叶栎种质资源库的2年生实生容器苗。4月初将苗木移栽到聚丙烯塑料花盆中（上口径14 cm×高12 cm），随后置于南京林业大学（32°04′41″N，118°48′33″E）遮雨棚中缓苗，期间进行统一的水肥管理。

试验盆栽用土为江苏省新沂市马陵山小叶栎种质资源库原土，每盆土壤的干质量为1 kg，含盐量为0.6‰，pH值为6.56，全氮含量为2.09 g/kg，全磷含量为0.53 g/kg，全钾含量为2.32 g/kg，有机质含量为2.70%。

1.2 试验方法

2021年5月底，选取生长良好、长势一致的苗木用于NaCl胁迫试验。试验配制NaCl浓度分别为土壤干质量1‰、2‰、3‰、4‰的4个等体积不同浓度的盐溶液，并浇灌试验苗木，以去离子水浇灌的苗木为对照（CK），共计5个处理，每个处理3个重复，每个重复共30株。为避免应激效应和减少误差，盐溶液分3天浇灌3次，并利用托盘收集沥出的多余水分重新浇入容器中。试验浇灌完后第1天开始取样，取样部位为顶芽下方3～4轮处功能叶，此后每周取样一次，共取7次样，43 d后试验结束。所取样品用冰袋保存带回实验室，于冰箱中-80℃下保存待测。试验期间苗木置于遮雨棚中，晴天通风，雨天遮雨。

1.3 测定指标

1.3.1 生长指标

试验处理前与试验结束后（第43天）分别采用钢尺和游标卡尺测定全部试验苗木的株高（精确到0.1 cm）与地径（精确到0.01 mm）。在胁迫第1、8、15、22、29、36、43天调查苗木受害情况，采用金晓玲等[11]的方法对苗木各个时期受害程度进行评价，并计算苗木盐害指数，公式如下：

1.3.2 生理指标

采用 DJS—1D 电导仪（上海雷磁）测定相对电导率；硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量[12]；氮蓝四䂳（NBT）比色法测定SOD活性；愈创木酚法测定POD活性[13]；磺基水杨酸法测定脯氨酸含量；蒽酮比色法测定可溶性糖含量；考马斯亮蓝G—250法测定可溶性蛋白含量[12]。

1.3.3 数据处理

采用Excel 2019软件整理数据；采用SPSS 23.0软件对不同处理间生长及生理指标数据进行单因素方差分析和多重比较。每个指标数据均为3个重复的平均值，结果用平均值±标准差表示；采用Origin 8.1软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对小叶栎苗木生长的影响

由表1可知，NaCl胁迫处理导致小叶栎苗木出现不同程度的盐害症状，且随着胁迫时间和NaCl浓度的增加，盐害指数持续上升。胁迫初期，经过1‰与2‰NaCl处理的苗木仅叶尖、叶缘和叶脉出现发黄的症状，受害症状较轻，苗木整体表现良好；而经过3‰和4‰盐处理的苗木则受害较重，叶尖、叶缘焦枯，生长状况萎弱。胁迫后期，1‰盐溶液处理的苗木无致死现象，仅叶片部分发黄，但整体生长良好；2‰盐溶液处理的苗木出现个别死亡现象，苗木生长状况一般；而3‰与4‰盐溶液处理的苗木叶片大面积枯落，新梢枯萎，苗木生长状况极差。其中，在胁迫第43天，4‰浓度处理的苗木有超过三分之二死亡，超过苗木半数致死量。

表1 NaCl胁迫对小叶栎苗木盐害指数的影响Table 1 Effects of NaCl stress on the salt injury index of Q.chenii Nakai seedlings

不同浓度NaCl处理对小叶栎株高增量与地径增量产生了不同程度的影响。由表2可知，不同浓度的NaCl处理均降低了小叶栎株高增量和地径增量。与对照相比，1‰与2‰浓度处理苗木株高增量降低较少，而地径增量显著下降（P＜0.05），分别下降了0.34 和0.27 mm。当NaCl胁迫浓度为3‰和4‰时，苗木株高增量与地径增量均显著下降（P＜0.05），分别比对照减少了40.57%、57.03%（3‰处理）与35.30%、69.47%（4‰处理）。不同浓度的NaCl胁迫均抑制了小叶栎苗木生长，且在高盐浓度胁迫下，苗木生长抑制更为严重。

表2 NaCl胁迫对小叶栎苗木生长增量的影响†Table 2 Effects of NaCl stress on the growth increment of Q.chenii Nakai seedlings

2.2 NaCl胁迫对小叶栎叶片渗透调节物质含量的影响

2.2.1 NaCl胁迫对小叶栎叶片脯氨酸含量的影响

由图1可以看出，随着NaCl浓度的增加，小叶栎叶片中脯氨酸含量呈上升趋势。在1 ‰浓度处理下，小叶栎叶片中脯氨酸含量在11.69～21.83 μg/g范围内波动，与对照组相差不大。当NaCl浓度为2‰时，脯氨酸含量大体呈上升趋势，除胁迫第1天外，各胁迫时期均与对照差异显著（P＜0.05）。在胁迫第43天时脯氨酸含量为61.21 μg/g，小叶栎叶片通过增加脯氨酸含量以抵御NaCl逆境胁迫，但在3‰与4‰浓度处理下，叶片中脯氨酸含量大体呈先上升后下降趋势。在胁迫第15天时上升到最大值，分别为75.05和127.16 μg/g，是对照的3.76倍与6.37倍。随着胁迫程度的加深，细胞渗透调节能力达到极限开始逐渐失衡，叶片脯氨酸含量下降。

图1 NaCl胁迫对小叶栎叶片脯氨酸含量的影响Fig.1 Effects of NaCl stress on the proline content of Q.chenii Nakai leaves

2.2.2 NaCl胁迫对小叶栎叶片可溶性糖含量的影响

由图2可以看出，在胁迫前22天，小叶栎叶片中可溶性糖的含量基本随胁迫时间与胁迫浓度的增加而增加。在胁迫第1天，叶片中可溶性糖含量随胁迫浓度的增加而缓慢增长，各NaCl胁迫处理与对照之间无显著差异（P＞0.05）。而在胁迫第22天，除1‰处理外，其他胁迫处理均与对照差异显著（P＜0.05），各胁迫处理可溶性糖含量分别为对照的112.05%、137.55%、134.58%和166.59%。叶片中可溶性糖含量不断累积降低了胁迫条件下细胞水分渗透压，维持小叶栎的正常生长需要。但从胁迫第29天起，叶片中可溶性糖的含量随胁迫浓度的增加基本呈先上升后下降的趋势，在第43天各胁迫处理下的可溶性糖含量分别为39.32、45.86、46.70和45.45 mg/g，较各胁迫处理峰值分别下降了7.67%、18.88%、18.90%和25.35%，可能是高浓度NaCl胁迫破坏了小叶栎糖代谢系统，使得叶片中可溶性糖合成速率下降。

图2 NaCl胁迫对小叶栎叶片可溶性糖含量的影响Fig.2 Effects of NaCl stress on the soluble sugar content in Q.chenii Nakai leaves

2.2.3 NaCl胁迫对小叶栎叶片可溶性蛋白含量的影响

由图3可以看出，小叶栎叶片中可溶性蛋白含量的变化规律较为复杂。在胁迫第1天，除4‰处理外，其他胁迫处理下叶片可溶性蛋白含量均低于对照，各胁迫处理与对照之间差异显著（P＜0.05），4‰ NaCl处理下可溶性蛋白含量为12.16 mg/g，是对照的1.09倍。自胁迫第15天起，各胁迫处理可溶性蛋白含量随NaCl浓度的增加而增加，除1‰处理外，其他NaCl胁迫处理叶片中可溶性蛋白含量均高于对照，分别为对照的100.46%、103.95%和105.42%，这种变化可能是因为在NaCl胁迫下小叶栎逆境蛋白合成加强，或者细胞膜受损后膜蛋白水解为可溶性蛋白。但在胁迫第29天后，可溶性蛋白随胁迫浓度增加总体为不断下降的趋势。在胁迫第43天，各胁迫处理叶片中可溶性蛋白含量分别为13.22、11.25、10.21和10.75 mg/g，是对照的1.19、1.01、0.92和0.97倍，可溶性蛋白合成细胞器损伤，新蛋白的合成受到抑制，叶片可溶性蛋白含量下降。

图3 NaCl胁迫对小叶栎叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effects of NaCl stress on the soluble protein content in Q.chenii Nakai leaves

2.3 NaCl胁迫对小叶栎叶片膜透性和膜氧化产物的影响

2.3.1 NaCl胁迫对小叶栎叶片相对电导率的影响

由图4可以看出，随着NaCl胁迫浓度与胁迫天数的增加，小叶栎叶片的相对电导率呈明显上升趋势。其中，除胁迫第15天外，1‰浓度NaCl处理下的各时段与对照均无显著差异（P＞0.05），但在3‰和4‰ NaCl浓度处理下，除胁迫第15天外，各胁迫时间段NaCl处理与对照均显著差异（P＜0.05），各胁迫时段的叶片相对电导率均远大于对照，在胁迫第43天，4‰浓度NaCl处理的叶片相对电导率高达97.15%，是对照的1.13倍，可见小叶栎苗木叶片质膜系统受损严重。

图4 NaCl胁迫对小叶栎叶片相对电导率的影响Fig.4 Effects of NaCl stress on the relative electrical conductivity of Q.chenii Nakai leaves

2.3.2 NaCl胁迫对小叶栎叶片MDA含量的影响

由图5可以看出，随NaCl胁迫时间的延长，叶片中MDA含量总体呈先上升后下降的趋势，各胁迫处理均在胁迫第29天达到最大值，分别为0.070、0.070、0.078和0.079 μmol/g。其中，4‰浓度处理的小叶栎叶片中MDA含量最高，是对照的1.29倍。胁迫前期，小叶栎叶片细胞膜代谢正常，各胁迫处理下MDA含量在0.056～0.066 μmol/g范围内波动，与对照差异不显著（P＞0.05）。但在胁迫后期，细胞膜受损，小叶栎叶片内膜脂过氧化作用加剧，MDA含量随NaCl浓度增加呈上升趋势。在胁迫第43天，1‰与2‰ NaCl浓度处理的MDA含量低于对照（0.061 μmol/g），分别为0.056和0.059 μmol/g，而3‰与4‰浓度处理下MDA含量高于对照，分别为0.067和0.073 μmol/g。

图5 NaCl胁迫对小叶栎叶片MDA含量的影响Fig.5 Effects of NaCl stress on the MDA content in Q.chenii Nakai leaves

2.3.3 NaCl胁迫对小叶栎叶片SOD活性的影响

由图6可以看出，随胁迫时间的延长，小叶栎叶片中SOD活性整体呈现先上升后下降趋势，除1‰盐浓度处理外，各胁迫浓度处理均在胁迫第22天达到峰值，分别为1 249.43、1 443.71和1 393.20 U/g，3‰胁迫处理下SOD活性最高，是对照的1.83倍。其中，在1‰和2‰胁迫处理下，叶片SOD活性在胁迫各时段均高于对照，除胁迫第1天外均与对照差异显著（P＜0.05）。而3‰和4‰处理下在胁迫各时段与对照均差异显著（P＜0.05），且在峰值（第22天）前叶片中SOD活性高于对照，SOD活性的增加以清除过多的O2-，在峰值后SOD活性低于对照，对小叶栎苗木的保护作用开始逐渐减弱。

图6 NaCl胁迫对小叶栎叶片SOD活性的影响Fig.6 Effects of NaCl stress on the SOD activity in Q.chenii Nakai leaves

2.3.4 NaCl胁迫对小叶栎叶片POD活性的影响

由图7可以看出，在胁迫处理下，各胁迫浓度处理小叶栎叶片中POD活性均呈下降趋势，且胁迫浓度越高，下降幅度越大，与对照差异越显著（P＜0.05）。其中，1‰和2‰浓度处理的叶片中POD活性表现为较慢的下降量和下降幅度，而3‰和4‰浓度处理则相反。在3‰与4‰浓度处理下，除胁迫第1天外，其余各时期POD活性均低于对照。在胁迫第43天，苗木POD活性分别降至847.20和623.2 U/g·min，仅为对照的24.18%和17.79%。可以看出，3‰与4‰ NaCl胁迫处理严重影响了小叶栎叶片POD活性，损害了抗氧化系统对苗木的保护作用。

图7 NaCl胁迫对小叶栎叶片POD活性的影响Fig.7 Effects of NaCl stress on the POD activity in Q.chenii Nakai leaves

2.4 NaCl胁迫对小叶栎苗木影响的综合分析

2.4.1 NaCl胁迫下小叶栎苗木半抑制浓度的确定

根据盐害系数计算回归方程得到小叶栎苗木的半抑制浓度（表3）。结果表明，在胁迫第1天与第43天小叶栎苗木回归方程拟合度较低，可能是由于NaCl处理胁迫时间太短或太长，导致盐害系数差异变化不显著，排除这两个时间点的半抑制盐浓度，计算其他5个有效时间点半抑制浓度的平均值为3.15‰。另外，在胁迫第15天，小叶栎回归方程拟合度最高，为1.000，半抑制浓度为3.50%。两者结合小叶栎苗木的半抑制浓度范围为3.15%～3.50%。

表3 NaCl胁迫下小叶栎苗木的回归方程及半抑制浓度Table 3 Regression equation and semi-inhibitory concentration of Q.chenill Nakai seedlings under NaCl stress

结合本试验胁迫处理浓度，取3‰处理浓度为小叶栎苗木的半抑制浓度。

2.4.2 NaCl胁迫下小叶栎生长与生理指标的相关性分析

由表4可知，小叶栎苗木盐害指数与叶片相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量呈极显著正相关，与苗木株高增量和叶片POD活性呈极显著负相关。小叶栎苗木受到NaCl胁迫后，苗木株高增长受到抑制，叶片质膜透性增加、胞内有毒物质积累，刺激脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质的积累，同时SOD和POD等抗氧化酶系统开始发挥作用，共同抵御NaCl胁迫。

表4 NaCl胁迫对小叶栎苗木生长与生理指标的相关性分析†Table 4 Correlation analysis of the growth and physiological indexes of Q.chenii Nakai seedlings under NaCl stress

2.4.3 NaCl胁迫下小叶栎生长与生理指标的主成分分析

将小叶栎对NaCl胁迫响应的10个指标分离成2个主成分（表5）。其中，盐害指数、POD、相对电导率、MDA、脯氨酸、可溶性糖、株高增量和可溶性蛋白为第1主成分，特征值为6.700，贡献率为67.00%，SOD、地径增量为第2主成分，特征值为1.360，贡献率为13.60%，第2个主成分累计贡献率为80.61%。试验测定的10个指标均能够较好地反映出小叶栎苗木对NaCl胁迫的生长及生理响应特性，其中，盐害指数、POD、相对电导率、MDA、脯氨酸、SOD等指标可作为小叶栎遭受NaCl胁迫的鉴定指标。

表5 NaCl胁迫对小叶栎苗木生长与生理指标的主成分分析Table 5 Principal component analysis of the growth and physiological indexes of Q.chenii Nakai seedlings under NaCl stress

2.4.4 小叶栎苗木对NaCl胁迫的综合评价

植物的耐盐能力由多个生长及生理指标共同决定[14]，为综合评价小叶栎对不同NaCl胁迫的响应程度，本研究采用综合分析法对小叶栎遭受盐胁迫过程中10个生长及生理指标进行综合评价分析。结果表明，随着NaCl胁迫浓度的加深，小叶栎苗木生长及生理响应愈加强烈，苗木受害状况越严重。小叶栎苗木受胁迫响应程度大小依次为4‰＞3‰＞2‰＞1‰＞0（CK）（表6）。

表6 小叶栎苗木对NaCl胁迫程度综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of Q.chenii Nakai seedlings under NaCl stress

3 讨论与结论

3.1 讨 论

盐胁迫条件下，植物往往通过调节外部形态来反映其受伤害程度。外部形态的变化是植物对盐胁迫响应的最直观表现，如叶片发黄枯落、新梢枯萎、苗木生长缓慢或停止等[15]。本研究中，不同浓度的NaCl处理均会对小叶栎苗木的生长产生一定程度的影响，且NaCl浓度越高产生的不利影响越明显。1‰与2‰ NaCl处理对苗木株高增量产生抑制作用但影响不显著，而3‰与4‰ NaCl处理则显著抑制了小叶栎的生长，随着NaCl胁迫浓度不断加深，小叶栎消耗更多的能量以维持自身体内生理生化反应的平衡，最终抑制了苗木的生长。这与马剑等[16]对文冠果Xanthoceras sorbifolium、胡爱双等[17]对八棱海棠Malus robusta植株耐盐性的研究结果一致。然而，不同树种有着不同的耐盐阈值，本研究中，小叶栎苗木生长半抑制浓度范围为3.15‰～3.50‰，高于紫花地丁[18]Viola vedoensis的2‰和大花四照花[15]Cornus florida的3‰，但低于银水牛果[19]Shepherdia argentea的6.30‰与构树[20]Broussonetia papyrifera的6.75‰～6.90‰，与盐生植物相比，小叶栎苗木对NaCl胁迫更加敏感，但也具有一定的耐盐性。

植物在NaCl胁迫下会积累大量的可溶性渗透调节物质，如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等，以维持细胞膨压，保证原有的生理过程正常进行，从而减轻NaCl胁迫对植物的伤害[21]。前人研究了盐胁迫下构树[20]、石竹[22]Dianthus chinensis等体内渗透物质的变化情况，结果表明，脯氨酸、可溶性糖与可溶性蛋白是细胞内最有效和最重要的有机渗透调节物质之一，能够有效地维持原生质与环境的渗透平衡，保护生物大分子结构与功能的稳定[23]。本研究中，随着胁迫时间的延长，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量总体呈先上升后下降的趋势，且NaCl浓度越高趋势越明显。在胁迫初期，不同浓度NaCl处理主要对小叶栎苗木形成渗透胁迫，造成细胞脱水[24]，可溶性渗透调节物质的积累能够有效增加细胞液浓度，降低渗透势，缓解渗透胁迫。但在NaCl胁迫后期，小叶栎苗木受害程度的不断加深使得苗木细胞质膜系统被破坏。生理代谢功能出现紊乱，可溶性渗透调节物质合成受阻，细胞内的渗透调节物质含量下降，这与王涛等[25]对紫穗槐Amorpha fruticosa的研究结果相似。

质膜透性是衡量细胞稳定性与完整性的重要指标之一。在NaCl胁迫下，活性氧自由基产生与清除的动态平衡被打破，活性氧生成加快，代谢清除功能减弱。大量的活性氧在体内累积，诱发细胞膜脂过氧化，形成MDA及其类似物，损伤生物大分子并破坏细胞质膜结构，导致细胞受伤甚至死亡[26-28]。在NaCl胁迫下，细胞内主要的酶促抗氧化剂SOD、POD以及其他酶类相互联系，共同协作清除代谢过程中多余的活性氧，维持活性氧的动态平衡，减少膜脂过氧化以及其他伤害过程[29]。在本研究中，低盐胁迫下（1‰与2‰ NaCl处理）小叶栎苗木叶片相对电导率上升，体内细胞酶促防御系统被激活，SOD与POD保持较高活性，有效地清除了细胞内多余的活性氧自由基，降低了叶片MDA含量。但在高盐胁迫下（3‰与4‰处理），随着胁迫程度的不断加深，叶片相对电导率不断上升，叶片内SOD活性上升难以抑制MDA含量的累积，细胞抗氧化酶系统逐渐异常，叶片抗氧化酶活性急剧下降，MDA及其类似物含量累积增加，小叶栎苗木损伤严重，这与刘学良等[30]对接骨木Sambucus williamsii的研究结果相似。

本研究探讨了NaCl胁迫对小叶栎苗木生长和生理方面的影响，但未对苗木光合生理、根茎叶中Na+、K+浓度和内源激素含量进行系统研究，有待进一步深入探讨。

3.2 结 论

不同浓度NaCl处理均对小叶栎生长及生理造成一定程度的影响，但影响程度各异。低浓度（1‰、2‰）NaCl处理的小叶栎苗木体内渗透物质增加、SOD与POD活性增强，植物自身经过一系列生理生化调节后，基本能适应低盐逆境环境。而高浓度（3‰、4‰）NaCl处理的苗木损伤严重，且随着胁迫程度的加深，苗木死亡量增加。结合胁迫过程中苗木生长和生理指标的变化情况以及耐盐性综合分析可知，盐胁迫中3‰浓度的NaCl可作为小叶栎苗木在江苏滨海地区推广的临界参考浓度。