冯娟娟 王正位 张晨 刘媛媛 程广舟 王磊

1济宁医学院附属滕州市中心人民医院泌尿外科，滕州 277500；2济宁医学院附属滕州市中心人民医院神经内科，滕州 277500

目前，干细胞技术在阴茎勃起功能障碍诊治中的研究已成为热点问题［1］。干细胞具有多潜能自我复制能力，能够分泌组织细胞所需的细胞因子甚至分化为相应组织细胞，使得受损细胞恢复功能甚至再生［2］。其中，肌源性干细胞是一种具有增殖分化潜能的、未向任何方向定型的原始成体干细胞［3-5］，已初步应用于基因治疗和组织工程等领域［6-7］，而且，Kovanecz等［3］已证实了阴茎海绵体中存在着内源性干细胞。正源于此，学者认为阴茎海绵体内源性干细胞有望为勃起功能障碍的治疗开辟新途径。但是，肌源性干细胞的相关研究仍存在诸多方面难题亟待解决，其中，肌源性干细胞在体外纯化、扩增、定向分化等便是关键问题。目前，已有相关研究证实某些生物活性因子能够作用于干细胞的增殖并产生促进增值的作用［8-9］，其中研究比较深入者便是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF又称作FGF-2，属于FGF1亚家族，bFGF作为一种信号分泌蛋白几乎在所有组织中都有表达［10］。bFGF 与细胞膜上的酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）结合产生生物学活性，促进细胞黏附、增殖、分化，其在伤口愈合、损伤修复和组织再生中的相关报道较多［11-12］，而将其用于肌源性干细胞的增殖的相关研究报道较少［13-15］，为此，本课题以大鼠阴茎肌源性干细胞作为研究对象，进一步了探讨了外源性bFGF对其体外增殖的作用效果，现报道如下。

材料与方法

1.一般资料

本试验自2020 年12 月至2021 年6 月在滕州市中心人民医院精准实验室完成。选取健康雄性Wistar大鼠5只，体质量（200±50）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［使用许可证号：SYXK（鲁）20180002，生产许可证号：SCXK（鲁）20200003］。主要试剂与仪器：胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、Percoll分层液、DMEM/F12培养基、胎牛血清（上海源聚生物科技有限公司，中国）；Sca-1 及Desmin 免疫组化试剂盒（UCL 公司，美国）；外源性bFGF（珠海生物制品有新公司，中国）；CO2培养箱（上海医疗器械有限公司，中国）；奥林巴斯Ⅸ51荧光倒置显微镜（上海普赫光电科技有限公司，日本）；SW-CJ-1FD超净台（苏州江东精密仪器有限公司，中国）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）酶标仪（北京普朗新技术有限公司，中国）。

本试验动物符合3R 原则，试验通过济宁医学院附属医院医学科学研究伦理委员会批准（2020B002）。

2.实验方法

取大鼠阴茎海绵体组织消化、培养，通过密度梯度离心法进行纯化［16］。细胞存活率≥95%时再进行下一步实验。运用改良的Preplate 差速贴壁法［16］进行传代培养。通过细胞玻片、PBS 漂洗细胞铺片、细胞固定、水化、通透、加入灭活酶、一抗、二抗、封片逐步进行Sca-1、Desmin 的免疫荧光细胞化学鉴定，同步设定阴性对照。最后通过荧光显微镜观察拍照，照片采用Image-Pro PLUS 5.0软件进行处理。应用苏木精-伊红染色观察肌源性干细胞的形态。

MTT比色实验。加样：取第2代肌源性干细胞，先用0.1%胰酶消化后，再用生长培养基重新悬浮，以1×106/ml 浓度、200 µl/孔接种于96孔板，设置5块试验板。A板为实验组：分别加入终质量浓度为10 µg/L、30 µg/L、50 µg/L、70 µg/L、90 µg/L 外源性bFGF；B、C、D、E 板的实验组生长因子终浓度均为90 µg/L。5 块板均设立空白对照组（每孔加200 µl生长培养基）、阴性对照组（每孔加200 µl生长培养基+肌源性干细胞）。均放于37 ℃、5%的CO2孵箱中培养。呈色：5板分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h呈色。

3.统计学方法

通过SPSS 21.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，实验组与对照组比较采用独立样本t检验，多重比较采用Tukey 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1.体外培养大鼠阴茎肌源性干细胞的形态观察

刚分离的肌源性干细胞贴壁缓慢，少量细胞仍处于悬浮状态，数量少且体积小，多呈球形，有一定折光性，绿色箭头示贴壁的球形细胞，黄色箭头示悬浮于培养液中的少量细胞，见图1A；原代培养3 d后PP6中悬浮细胞消失，贴壁后的细胞特点：体积增大，可见细长梭形或纺锤形，见图1B；培养4 d 时细胞特点：向对方伸出小的突起，呈网状趋于融合，趋于平行排列，此时肌源性干细胞已融合形成多核肌管，并可见肌管收缩，见图1C；培养4 d后，苏木精-伊红染色可见肌源性干细胞呈梭形平行排列，见图1D。

图1 体外培养大鼠阴茎肌源性干细胞的形态学观察。A 为刚分离的肌源性干细胞（×100），绿色箭头示贴壁的球形细胞，黄色箭头示悬浮于培养液中的少量细胞；B 为原代培养3 d 后PP6 中贴壁后的肌源性干细胞（×100）；C 为培养4 d 时的肌源性干细胞（×100）；D 为培养4 d 后经苏木精-伊红染色的肌源性干细胞（×200）

2.肌源性干细胞的鉴定及流式细胞仪检测

通过免疫细胞化学染色检测PP6 及传代培养细胞，肌源性干细胞标记物Sca-1、Desmin 的表达情况，荧光显微镜下见：PP6 及传代细胞均能表达Sca-1、Desmin，且随着代数的增加，免疫荧光阳性率无明显降低，见图2A；PP6 细胞流式细胞仪检测，Sca-1 表达量为（79.90±1.82）%，见图2B；少数呈Desmin 阳性反应，表达量为（68.60±0.72）%，其流式细胞检测见图2C。

图2 大鼠阴茎肌源性干细胞的鉴定及流式细胞仪检测。A为PP6及传代培养细胞（×100）；B为肌源性干细胞中Sca-1检测结果；C为肌源性干细胞中Desmin检测结果

3.MTT比色实验结果

在不同培养时间点，外源性bFGF对肌源性干细胞的促增殖效应不同，随培养时间的延长，肌源性干细胞增殖逐渐加强。培养24 h、48 h与72 h，两组肌源性干细胞数量均增多，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；实验组出现显著促增殖效应的培养时间为96 h、120 h、144 h（均P＜0.01），且在此时间点，实验组的增殖效应均明显高于对照组（均P＜0.01）；但培养96 h 之后两组增殖效应均不再继续增加，反而呈下降趋势。见图3。

图3 不同培养时间点大鼠阴茎肌源性干细胞的生长曲线示意图

4.不同终浓度的外源性bFGF 对肌源性干细胞的促增殖效应

培养96 h 时MTT 法检测两组肌源性干细胞增殖效应，发现不同终浓度的外源性bFGF 对肌源性干细胞的促增殖效应也不同。与对照组比较，加入10 µg/L（t=3.657，P=0.022）、30 µg/L（t=7.483，P=0.002）、50 µg/L（t=4.821，P=0.009）、70 µg/L（t=7.7461，P=0.001）及90 µg/L（t=7.839，P=0.001）bFGF 实验组均明显高于对照组的增殖效应；实验组中肌源性干细胞的增殖作用在10～70 µg/L 区间内随终浓度升高而显著增强（均P＜0.01）；但是从70 µg/L 到90 µg/L时其促增殖作用不再继续增强，其间增值效应比较差异无统计学意义（P=0.374）。见图4。

图4 不同终浓度的外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠阴茎肌源性干细胞的促增殖效应

讨论

向多细胞系分化和自我更新潜能是肌源性干细胞的独特之处，有研究发现即便是在无诱导因素作用下，其也可定向分化为肌细胞和肌组织［17］。要研究肌源性干细胞的增值，首先要精确地对其进行鉴定，Sca-1 是目前最常用于鉴定干细胞的标志物，而Desmin 是最常用于鉴定肌源性干细胞的标志物，可用于筛选肌肉来源与非肌肉来源的组织［18］。本实验测定了大鼠阴茎海绵体中Sca-1 和Desmin 的表达情况，结果显示少量存在Sca-1 和Desmin 同时表达的双阳性细胞，即同一个细胞既具有干细胞特异性，又具有肌源性细胞的特异性，因此我们发现了海绵体组织中有肌源性干细胞存在的证据。但是，肌肉组织中肌源性干细胞的数量较少，因此，如何使得肌源性干细胞能够在体外有效地得到纯化、扩增、定向分化，成为目前研究肌源性干细胞增殖的热点问题。

近期，bFGF 被广泛用于细胞的体外培养增殖、诱导分化以及体外组织再生领域，是一种极具应用潜力的生长因子之一［10-12］。目前，诸多学者进行了利用bFGF 扩增的方法促进干细胞的增殖的研究，如李娜等［19］利用bFGF集落胚胎干细胞，促进其高效增从而获得了丰富的造血干细胞；巴云涛等［20］对人脐带Wharton's jelly 源的组织块进行分离培养，应用bFGF对其增殖过程进行干预，培养出了可观的具有间充质干细胞特性的细胞；吕丹等［21］已将外源性bFGF用于大鼠肌源性干细胞增殖研究，并取得了良好效果；王童等［22］将bFGF 作用于脑创伤SD 大鼠大脑侧室中，发现神经干细胞的增殖与分化明显提高。以上研究均充分证明bFGF 能促进细胞从组织块的分离，且有助于促使细胞贴壁，而且一定程度上维持细胞形态稳定性，提高了细胞的增殖能力，并且未改变细胞的表面标志物表达，以便于进一步对细胞特性的鉴定。

结合以上研究，目前认为bFGF可促进肌源性干细胞的增殖与分化的作用机制可能为：（1）bFGF 保守性较强，在各种生物体内有着很高的同源性［12］，杨竣等［23］检测出了大鼠血清及阴茎组中bFGF 的含量高达（10.53±0.42）µg/L 和（985.8±76.8）pg/mg protein，并发现其与阴茎海绵体肌的含量变化有着密切关系。（2）肌细胞中可能有bFGF 特异性受体存在［22］。生长因子通过与肌细胞上相应受体结合启动肌细胞内信号转导通路，或者与可溶性的相应受体结合，进而作用于其他具有bFGF 受体或类似受体的非神经元和非肌细胞，从而改变肌源性干细胞生存的微环境而发挥作用［24-27］。例如Xie等［28］以高脂血症大白兔为研究对象，向其海绵体肌内注射bFGF 后发现其海绵肌含量及血管活性药物的舒张程度明显增加，并进一步检测发现阴茎海绵体肌内血管内皮生长因子（VEGF）和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）的蛋白表达水平明显升高，发现bFGF 主要是通过促进VEGF 蛋白表达，导致其下游的蛋白激酶B 和eNOS 磷酸化，最终提高阴茎组织对血管活性药物的敏感度。（3）bFGF 与受体结合后形成受体配体复合物，定位于细胞核后，作为一种细胞分裂原，在有丝分裂G2M期，其受体FGFR 是酪氨酸激酶型受体，与配体结合后激活c/Frs-Raf/MAPKKK-MAPKK-MAPK 通路，作用于RNA 聚合酶Ⅰ并影响其活性，导致核蛋白体基因的转录加强，加快了细胞周期的转换，通过刺激引物合成刺激了细胞的DNA 合成增强，通过缩短细胞周期，从而促进细胞的分裂与增殖［29-30］。胡文龙等［31］发现bFGF 能够调节人脐带间充质干细胞的细胞周期；（4）bFGF 作为一种信号蛋白，通过靶向作用于相关miRNA 影响干细胞分裂和分化，如miR-138 和miR-23b 受bFGF 影响在干细胞成骨和成软骨的增值、分化过程中发挥更显著的作用［32］。

本研究中发现，bFGF 不仅可促进大鼠阴茎肌源性干细胞的增殖，而且其促进增值效应与培养时间、终浓度密切相关。我们发现：（1）bFGF 的促增殖效应随培养时间的延长而逐渐升高，但并非随时间延长而无限增加，当培养时间达到96 h时，增殖效应将不再继续增加，这与bFGF 作为细胞分裂源的机制相一致。（2）肌源性干细胞的增殖效应与bFGF 终浓度呈正相关性，即增殖效应随终浓度增大而一定限度内逐步提高。白燕等［33］在研究bFGF 对骨髓间充质干细胞成骨诱导作用时，发现bFGF 质量浓度达到10 µg/L 时会达到饱和状态，产生结节的数量不会再随质量浓度升高而增加，反而出现抑制作用。同样，我们也发现肌源性干细胞的增殖效应随着终浓度从10 µg/L～70 µg/L 升高的区间内也随之增强，当终浓度达到70 µg/L时，其增殖效应达到巅峰，且不再继续增加，反而有下降趋势。即过高的终浓度不仅不会再对细胞分化产生促进作用，反而会产生抑制作用，这种现象与bFGF 受体具有特异性、饱和性的特点相一致，因此选择合适的培养终浓度也至关重要。另外，因为bFGF 有着不稳定性的特点，随着培养时间的延长，bFGF 的浓度也会随之下降，便会减缓肌源性干细胞的增值、分化效率，所以在细胞培养基中需要持续补充bFGF 以维持其浓度，这也是十分重要的。

本研究初步探讨了bFGF 对肌源性干细胞的促增殖作用，对肌源性干细胞培养方案优化的研究提供了些许经验。但是，其增值作用是否具有靶向性，是否与其他物质具有联合作用，且作用机制与效果如何，作用可控性等问题仍需进一步深入研究。

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