任冰倩,汪锋*,陆姝欢,马凡提

(1.武汉工程大学 化工与制药学院,湖北 武汉 430205;2.嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司,湖北 武汉 430073)

β-胡萝卜素(C40H56)是一种类胡萝卜素,是一种橘黄色的脂溶性化合物,广泛存在于各种植物、藻类、真菌和细菌中,是一种的天然的色素[1-2]。β-胡萝卜素纯品的外观呈现深红紫至暗红色,带有轻微异臭或异味[3]。β-胡萝卜素遇氧、热及光不稳定,易溶于石油醚、乙酸乙酯、氯仿、己烷及植物油等,几乎不溶于甲醇和乙醇,也不溶于水、丙二酮、甘油、酸和碱[4-5]。β-胡萝卜素不仅仅是良好的维生素A源,还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、增强机体免疫能力等功能,被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域[6]。因为天然β-胡萝卜素生理活性高,所以市场上合成的β-胡萝卜素的价格仅为天然β-胡萝卜素的1/3左右,并且天然β-胡萝卜素取得了美国食品药物管理局(FDA)的认可,已列入美国药典[7],并在50多个国家和地区被批准使用。全球β-胡萝卜素年生产量从2003年的600 t,增长至2020年的1 000 t,产业规模也不断扩大[6,8]。随着全球居民对健康越来越重视,天然β-胡萝卜市场需求将继续增长。随着发展中国家对β-胡萝卜素需求的不断增大,以及保健品行业和健康食品产业的快速蓬勃发展,全球β-胡萝卜素行业仍将继续扩大。现就β-胡萝卜素的生产、提取和功能作一综述。

1 β-胡萝卜素的生产方法

1.1 化学合成法

化学合成法是通过化学反应人工合成β-胡萝卜素的一种方法[9]。β-胡萝卜素的产业规模自1953年实现工业化合成开始不断发展扩大,如今主要的生产商有罗氏公司和巴斯夫公司[10]。C16+C8+C16,C19+C2+C19,C20+C20,C15+C10+C15是目前合成β-胡萝卜素4种主要路线[11]。汤丹丹[12]以紫罗兰酮为原料,对C15+C10+C15合成β-胡萝卜素的路线进行优化,得到纯度为96%的β-胡萝卜素固体。与天然β-胡萝卜素相比,化学合成的β-胡萝卜素在光照、加热、空气氧化条件下较稳定。李昆明[13]改进β-胡萝卜素的中试工艺条件,解决了残留溶媒处及甲苯套用等一系列问题,有效减少后处理次数,提高产品收率和纯度。虽然化学合成方法已从步骤繁多、反应条件苛刻、原料危险系数高和污染大向反应简单、易操作、反应条件温和、原材料价廉易得和收率高等方面转变[10],但是化学合成的β-胡萝卜素不具备天然β-胡萝卜素的许多生理功能[14],不能被人体完全吸收,会给人体带来一定的毒副作用,长期服用还可能会产生病变[10,15]。在我国,只有C20+C20路线合成的β-胡萝卜素,也就是从维生素A乙酸酯为原料化学合成的β-胡萝卜素能作为食品添加剂使用,赋予食品色泽。

1.2 植物提取法

自然界中存在大量的β-胡萝卜素资源,但其在生物体内的含量一般仅占生物体干重的0.2%左右[16-17]。天然的β-胡萝卜素的主要来源是植物、藻类中提取以及微生物发酵[18]。从β-胡萝卜素含量丰富的天然植物或其下脚料,利用有机溶剂萃取、超声提取、超临界流萃取等方法,可提取到天然的β-胡萝卜素[2,19]。张岩等[20]通过高效液相色谱法分析白莲花粉中的β-胡萝卜素,确定白莲花粉中的β-胡萝卜素含量较丰富,并采用有机溶剂法对白莲花粉中β-胡萝卜素进行提取,提取量为596.22 μg/g。藻类特别是杜氏盐藻富含β-胡萝卜素,且藻类的适应能力强[21],所以经常被用于β-胡萝卜素的生产研究。但藻类的生长繁殖易受到产地、气候等因素的影响,导致以藻类为原料提取β-胡萝卜素的成本较高、提取收率差异大,难以实现大规模生产[22]。虞海天等[23]将杜氏盐藻综合利用,不仅从杜氏盐藻中提取β-胡萝卜素,还利用杜氏盐藻中的油脂制成生物柴油。

1.3 微生物发酵法

随着生物技术的发展,β-胡萝卜素的发酵生产技术基于现代发酵技术和生物反应器技术的进步得到了快速发展[22]。目前常用的微生物有红酵母、布拉克须霉菌、三孢布拉氏霉菌等[24]。唐玲[25]优化了三抱布拉氏霉菌种子培养基和发酵培养基,将β-胡萝卜素的产量提高至13.79 mg/L。张磊[22]先建立了丝状真菌分离单菌落的方法,稳定菌株性能,同时也提高了三孢布拉霉单菌落发酵β-胡萝卜素的能力,再将高通量筛选技术与三孢布拉霉诱变选育技术相结合得到高产突变株,最后通过单因素和响应面优化研究确定高产β-胡萝卜素的工艺条件,奠定了三孢布拉霉发酵产β-胡萝卜素产业化的基础。微生物发酵得到的β-胡萝卜素有生物活性,且生产β-胡萝卜素不受外界环境的限制,生产周期短,生产安全性高,成本低廉[6]。

1.4 基因工程法

微生物合成β-胡萝卜素需由法尼基焦磷酸先后经过六氢番茄红素合酶、六氢番茄红素脱氢酶,番茄红素环化酶的催化转化而成[26],所以基因工程法利用的工程菌是一些能合成法尼基焦磷酸的微生物[2]。研究发现4个crt基因(crtE、crtB、crtI、crtY)控制FPP合成β-胡萝卜素[2]。尹升明[27]在耶罗维解脂酵母导入β-胡萝卜素合成基因,使β-胡萝卜素的产量达到613.63 mg/L。王岩岩[28]构建的生产β-胡萝卜素的基因工程菌株是具有成团泛菌P.agglomerans的基因簇crtEYIB的大肠杆菌。利用转基因技术减少了发酵过程中的副产物,优化菌株代谢路径,提高了生物体内β-胡萝卜素的含量并增加了β-胡萝卜素的产量,已成为当前研究的热点。

2 β-胡萝卜素的提取方法

2.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是一种传统的提取活性物质的方法,其原理是利用溶剂与活性物质相似相溶性,使活性物质从原料内部转移到溶剂中。提取β-胡萝卜素常用的有机溶剂有乙酸乙酯、石油醚、正己烷等[29]。王海英等[30]进行了萃取剂、温度、时间、固液比对β-胡萝卜素提取率影响的单因素实验优化提取工艺,确定最佳提取工艺件为: 乙酸乙酯为萃取剂,65 ℃下恒温处理6 h,固液比为1∶10(mg∶mL)。陈玉萍等[31]通过单因素实验,确定以石油醚为溶剂提取辣椒中的色素时,适宜的提取条件为: 温度为50 ℃、料液比为1∶15(g∶mL)、浸提时间 1.5 h。有机溶剂提取法操作简单、工艺成熟、设备及投资成本较低,普遍应用于大规模工业化生产,但是溶剂的选择性不高、提取率比较低,而且产品中存在有机溶剂残留,会影响产品的质量[19-29]。β-胡萝卜素对氧气、热、光不稳定,该提纯方法还可能导致β-胡萝卜素的异构、氧化和降解[19]。

2.2 柱层析法

柱层析法是利用吸附剂对混合样品中各组分的吸附能力不同,使各个组分分离的方法,该法能有效分离多重组分的混合物,采用柱层析法对β-胡萝卜素进行提取纯化一般用吸附树脂、硅胶、中性氧化铝作为吸附剂[32]。聂艳玲[33]将牛蒡根中超声波辅助有机溶剂浸提所得的β-胡萝卜素提取液通过氧化铝柱纯化,确定洗脱剂为石油醚-丙酮(体积比6∶1)时,洗脱效果最佳。陈骁熠[34]通过正交设计试验,确定从胡萝卜中提取的β-胡萝卜素最佳工艺条件是:石油醚-丙酮的体积比为4∶1,氧化铝目数为200目(粒径0.075 mm),柱高为10 cm,加入稳定剂后提取率可达91.72%。与其他方法相比,柱层析法耗能低、溶剂易于回收再利用、产品纯度高[35],但是此法提取工艺复杂、耗时长且溶剂用量大,β-胡萝卜素还难以快速洗脱,所以在实际应用中,该法不适用于工业化生产[19]。

2.3 超临界CO2萃取法

超临界CO2(supercritical dioxide,SC-CO2)萃取法是一种常见的超临界流体萃取方法,利用处于临界压力和临界温度以上的流体的特性,使萃取物和萃取剂得到有效的分离,更有利于萃取[36]。姚萍等[37]将菠菜作为原料,采用超临界CO2萃取技术提取β-胡萝卜素,通过正交试验设计,确定最佳工艺条件为:萃取温度40 ℃,萃取压力20 MPa,萃取时间120 min,夹带剂用量10%,在此条件下,β-胡萝卜素的提取量达5.04 mg/100 g。孙瑞瑞[29]利用超临界CO2萃取紫苏油粕β-胡萝卜素,在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计方法和响应面分析法,确定最佳提取工艺为:萃取温度43 ℃、萃取压力38 MPa、萃取时间3 h,在此条件下,β-胡萝卜素得率为91.57%。超临界CO2萃取法具有更高效快速、无溶剂残留、无溶剂丢失、选择性强、操作条件温和,可以有效的保留萃取物中的易挥发性和热敏性成分等优点,并满足无溶剂β-胡萝卜素日益增长的需求[36,38-40]。然而,在实际操作过程中,需使用夹带剂来提高β-胡萝卜素在CO2中溶解度[19],而且超临界CO2萃取技术由于要求有一定的压力环境,其设备的成本较高,运行和维护的费用也多[38]。

2.4 超声辅助提取法

超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应可辅助提取天然产物成分,不仅破坏了细胞壁使得有效成分溶出,还增加溶剂和产物之间的接触表面积,增强传质,促进了细胞内可溶性化合物的释放,便于提取[41-44]。房明[32]利用超声波辅助提取螺旋藻中的β-胡萝卜素,通过响应面分析试验,确定最佳提取工艺参数为:甲醇-丙酮混合液4∶6(体积比)为提取剂,固液比1∶25(mg∶mL),超声功率51%,超声17 min,在该条件下β-胡萝卜素提取率为1 942.14 μg/L。Soumen Dey等[45]利用超声辅助从螺旋藻中提取β-胡萝卜素,研究了提取时间、溶剂类型、料液比、温度、电声强度、探针尖端长度、占空比、预处理时间等参数,确定最佳条件是1.5 g螺旋藻(2 min预浸泡在甲醇)在50 mL正庚烷于30 ℃,167 W/cm2电声强度和61.5%占空比,超声时间为8 min,探针尖端长度为0.5 cm,浸入表面提取溶剂中,在述最优参数下,最大提取量为47.10%,预处理时间为甲醇预处理,超声处理2 min后,β-胡萝卜素的提取率提高了12倍。超声波辅助提取法能节省提取溶剂,缩短提取时间,提高提取率,减少高温对有效成分的破坏,故对天然产物的提取常采用该法[45-46]。尽管有上述优点,但超声波辅助提取法应用于提取β-胡萝卜素时也存在一定的局限性,在实际应用中该法对原料的粒度大小、含水量等方面有诸多限制,还可能在提取过程中发生过热和热解降解,所以在将超声辅助提取应用于β-胡萝卜素时需控制好实验参数[43,46]。

2.5 微波辅助提取法

微波辅助提取是利用微波能加热来提高萃取效率的一种新技术,与导电加热不同[47],它可以同时均匀而迅速地加热整个样品,通过促进分子偶极子的旋转来破坏弱氢键,可以在短时间内破坏细胞壁,使溶剂非常容易地进入细胞内,溶解并释放细胞内的物质[31-36]。在微波场中,根据不同物质对微波能的吸收程度不同,可以选择性加热基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分,从而呈现出较好的选择性[48-49]。王颖等[50]以胡萝卜为原料微波辅助提取β-胡萝卜素,乙酸乙酯/无水乙醇混合液作为提取溶剂,通过单因素试验确定最佳工艺条件为:料液比1∶5(g∶mL),微波功率400 W、微波时间40 s,在此条件下,β-胡萝卜素的收率可达47.8%。孙协军等[51]从盐藻粉中采用微波辅助提取β-胡萝卜素,确定最佳工艺条件为:乙酸乙酯为溶剂,液固比232 mL/g,微波功率500 W,提取温度42 ℃,萃取时间7 min,搅拌转速180 r/min,在此条件下,β-胡萝卜素的收率为1.03%。微波辅助提取法提取β-胡萝卜素等天然产物可以节省时间,减少溶剂用量,提取效率高,设备简单且成本低,对环境的污染小[19]。但是微波加热的升温速率很快,难以控制,可能会导致β-胡萝卜素发生异构化[48-49]。

3 β-胡萝卜素功能

3.1 维生素A源

维生素A是主要包括视黄醇、视网膜、视黄酸和β-胡萝卜素的一组不饱和的有机化合物,其中最重要的是β-胡萝卜素[52]。维生素A不仅参与人体正常视觉的维持,而且在生长发育、细胞增殖分化、特异性和非特异性免疫、造血及调节代谢等方面发挥着广泛的调控作用,是人体不可或缺的微量营养元素[53]。

1919年,Steenkbock发现了β-胡萝卜素可能具有维生A素的生物活性,到1928年,Moore通过实验进一步证实了β-胡萝卜素可以在体内转化为维生素A[54]。在代谢过程中,机体内维生素A的含量变化是改变β-胡萝卜素的生物利用率的原因,当机体缺乏维生素A时,β-胡萝卜素的生物转化率升高,同时,该生物转化过程还会在体内有充足β-胡萝卜素时被抑制,避免了体内因维生素A过量而导致的中毒现象[54]。

3.2 抗氧化

β-胡萝卜素结构含有11个共轭多烯双键和2个紫罗酮环,具有较强的捕捉自由基的能力,能清除氧自由基、单线态氧,降低脂质氧化物的产生,缓解氧化应激带来的不良影响[54-55]。因此,β-胡萝卜素能够防止细胞损伤,每个β-胡萝卜素分子可猝灭多达1 000个自由基[56-57]。单线态氧猝灭可能仅局限于皮肤,因为皮肤是唯一含有较高水平的β-胡萝卜素的受光照的组织。在清除自由基后,β-胡萝卜素会分解,不能再生[58]。现阶段发现的β-胡萝卜素的抗氧化机制可能包括以下三点:(1)双键结构与自由基结合,使、能降低自由基活性或清除自由基;(2)通过电子交换能量转移,猝灭单线态氧;(3)促进核因子E2相关因子2( nuclear factor erythroid2-relatedfactor2,Nrf2) mRNA表达,通过激活Nrf2表达,促进机体合成抗氧化酶[59]。黎海利等[60]通过测定红肉火龙果果肉中提取的β-胡萝卜素对自由基超氧阴离子及DPPH自由基的清除率,并与维生素C对自由基超氧阴离子及DPPH自由基的清除率进行比对,证明具有较高的抗氧化活性。

3.3 抗肿瘤

β-胡萝卜素通过不同的机制能抑制癌细胞的增殖,诱导癌细胞凋亡且减少化疗的不良反应,对多种癌症都均有防治作用[19]。人们普遍认为,食用大量富含类胡萝卜素的水果和蔬菜的人会降低患癌症的风险[56]。已有大量的科学研究证明β-胡萝卜素对胃癌、结肠癌、乳腺癌以及前列腺癌等均有显著的抑制和预防作用[32]。同时有研究发现,β-胡萝卜素对结肠癌、前列腺癌的抑制仅作用于不吸烟的人,对吸烟的人则不会产生抑制效果,反而会促进癌症发病[6]。此外,β-胡萝卜素对乳腺癌有着较为显著的抑制作用,能使乳腺癌的发生率显著降低[61]。

3.4 其他功能

李若楠等[62]选用仔猪空肠上皮( IPEC-J2)细胞系建立体外细胞模型,采用MTT法检测细胞细胞活力,发现β-胡萝卜素能够提高脂多糖诱发的空肠上皮细胞炎症反应中闭合蛋白(Occludin)、钙黏蛋白(Claudin4)、带状闭合蛋白(ZO-1)紧密连接蛋白表达水平,推测出提高紧密连接蛋白表达水平是β-胡萝卜素对空肠上皮细胞的抗炎作用的途径之一。房明[32]通过建立糖尿病动物模型探究β-胡萝卜素的降血糖生物活性,发现β-胡萝卜素能有效抑制和减缓高血糖引起的病症,且不存在低血糖等副作用。

目前越来越多的临床试验已经证实了β-胡萝卜素具有治疗胃溃疡、萎缩性胃炎、矽肺病、复发性口腔溃疡,防治冠心病及预防心脑血管硬化,降低老年性黄斑变性和白内障的风险等功能[33]。

4 展望

β-胡萝卜素具有多种生物学功能,在医药、食品、化妆品等领域具有广泛的应用。随着人们对于健康不断的重视,β-胡萝卜市场需求将持续攀升。需探究一些大规模工业生产β-胡萝卜素的方法,并扩大β-胡萝卜素的来源,以满足人们对β-胡萝卜素日益增长的需求。