范晓丽，王 娟，王梨明

1桂林医学院药学院，广西 桂林 541100；2桂林医学院临床学院，广西 桂林541001

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤的首位［1］。在新发病例中，约85%的病人诊断为非小细胞肺癌［2］（NSCLC），主要包括腺癌、鳞癌和大细胞癌，其中肺鳞癌约占30%［3］。目前，对于肺鳞癌的治疗，仍以外科手术切除为主，其次为细胞毒性化疗和免疫治疗。近年来，驱动基因表皮生长因子受体、间变性淋巴瘤激酶的靶向治疗取得了非常好的效果［4,5］。但是，由于缺乏相应的治疗靶点，靶向治疗对于肺鳞癌患者受益很少［6］。肺鳞状细胞癌总体预后较差,存在较高的转移率和复发率，只有约18%的患者存活五年或更长时间［7］。因此，开发新的药物或者治疗方法仍是亟待解决的问题。

近年来，在传统中药中发现很多有效成分，成为肿瘤治疗的新策略。甘草查尔酮A（LCA）是一种从甘草中分离出来的类黄酮物质，具有抗炎［8］，抗氧化［9,10］和抗肿瘤［11］等多种药理活性，在体外抗肿瘤中的作用日益明显。研究表明，LCA在胃癌［12］、肝癌［13］，乳腺癌［14］，前列腺癌［15］以及骨肉瘤［16］等多种细胞系中具有抗肿瘤作用。LCA在肺癌中的研究很少，有课题组发现，LCA可以通过抑制肺癌细胞A549 和H460 增殖而发挥抗肿瘤作用［17］，在肺癌细胞株H292 中还可以通过上调mir-144-3p 引起内质网应激和细胞凋亡［18］。由于肺腺癌和鳞癌的病理类型不同，药物作用的机制也可能有很大不同。因此，探究LCA 在肺鳞癌中的作用很有意义。

PI3Κ/Akt信号通路是大多数人类肿瘤中最常激活的途径之一，在肺癌的发生和进展中起到非常重要的作用［19］，PI3Κ/Akt信号通路与细胞增殖相关，其激活可诱导细胞周期G1/S期转变［20］。有研究表明，许多药物可通过抑制PI3Κ/Akt信号通路抑制肿瘤的生长［21］。前期研究表明，LCA可能通过抑制PI3Κ/AΚT/mTOR信号通路在体外抑制肾癌细胞的增殖、侵袭迁移以及诱导自噬［22］。本研究中，我们检测了LCA在肺鳞癌H226细胞和异种移植模型中的抗肿瘤作用，并探究与PI3Κ/Akt信号通路的关系，以期为甘草查尔酮A用于临床治疗肺鳞癌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞系

人肺鳞癌细胞系H226购于中科院上海细胞所，用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基进行培养，细胞生长至对数期后进行实验。

实验分组：对照组（0.1%DMSO的培养液）、不同浓度的LCA溶液（10、20、40 μmol/L）。先将LCA溶解在DMSO中配制成120 mmol/L的储存液，使用时用培养液稀释至相应浓度。

1.2 药物与试剂

LCA（MCE），胎牛血清、RMPI 1640 培养基（GIBCO），胰蛋白酶和青链霉素、PBS及MTT试剂（索莱宝），RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天），CDΚ2、CDΚ4、CyclinD1、Akt、p-Akt、PI3Κ（110 000）以及p-PI3Κ（85 000）抗体（abcam），GAPDH（Proteintech），鼠二抗、兔二抗（北京依玛博科技有限公司）。

1.3 MTT实验

将H226细胞接种在96孔板中，根据预实验结果，加入不同浓度的LCA溶液（0、2、5、10、20、30 μmol/L）培养48 h，每组设置6个复孔。每孔加入20 μL的MTT溶液，于培养箱中继续孵育4 h后每孔加入150 μL的DMSO，避光在摇床混匀10 min，检测490 nm波长处的吸光度值（A值）。通过细胞抑制率计算48 h的半数抑制浓度。细胞增殖抑制率=（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.4 PI染色检测细胞周期

对数生长期的细胞以4×105/孔接种于6孔板，过夜贴壁后，加入终浓度为0、10、20 以及40 μmol/L 的LCA 处理48 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞，用70%的乙醇固定过夜，使用前，2000 r/min离心10 min，弃去70%冰乙醇，预冷的PBS洗涤1次，用0.5 mL RNase悬浮细胞后，37 ℃水浴30 min，最后加入PI避光染色30 min，300目筛网过滤，上机进行检测，实验重复3次。

1.5 Western blot检测相关蛋白的表达

对数生长期的细胞接种在7 cm培养皿中，加入相应浓度的LCA溶液（0、10、20、40 μmol/L），48 h后收集细胞，用碧云天的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，通过BCA法进行蛋白定量。定量20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜，室温下，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入相应的二抗，室温孵育1 h。通过化学发光液显色，通过Image Lab 6.0 软件分析蛋白灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.6 动物实验

无胸腺裸鼠（BALB/c-nu）购于湖南斯莱克景达实验动物公司，生产许可证：SCXΚ（湘）2019-0004，裸鼠饲养于桂林医学院实验动物中心SPF级动物房，本实验使用雄鼠，4周龄，共8只，适应性饲养1周后随机分为2组。LCA用含20%SBE-β-CD的生理盐水溶解。将1×107H226细胞种植入小鼠右侧腋下，大约7 d瘤体长径长至0.8 cm时，给予药物治疗，对照组小鼠注射含20%SBEβ-CD的生理盐水（200 μL），实验组小鼠注射15 mg/kg的LCA溶液（200 μL），注射1次/d，连续24 d，实验结束时，脱颈处死裸鼠，取肿瘤观察每组肿瘤大小，并称量肿瘤的质量。所有动物实验均通过桂林医学院动物伦理委员会审批（GLMC202103038）。

1.7 统计学分析

计量资料均采用均数±标准差来表示，每个实验至少重复3次。通过GraphPad Prism 5.0 软件进行数据作图。采用SPSS 22.0进行数据统计，多组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LCA处理H226细胞48 h的半数抑制浓度

不同剂量的LCA处理48 h后，H226细胞活力明显受到抑制，随着浓度的增加，其抑制作用越来越显著（图1B）。在LCA浓度为2、5、10、20及30 μmol/L时，细胞活力分别为（90.54±2.99）%、（86.31±3.33）%、（73.15±2.78）%、（60.56±2.45）%、（44.86±3.67）%，当LCA 浓度高于5 μmol/L 时，可以有效的抑制H226 细胞活力（P＜0.05）。LCA处理48 h，IC50为28.3 μmol/L。因此，我们选择10、20以及40 μmol/L的浓度进行下一步实验。细胞生长至密度大约40%左右，向培养皿中加入终浓度为0、10、20以及40 μmol/L的LCA，继续培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化（图1C），随着LCA浓度的增加，细胞数量明显减少。

图1 LCA抑制肺鳞癌H226细胞增殖Fig.1 LCA inhibits proliferation of H226 cells.A:Chemical structure of LCA.B:Viability of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h(Mean±SD,n=3).C:Morphology of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h.

2.2 LCA对H226细胞周期的影响

我们通过流式细胞术检测不同浓度LCA对H226细胞周期的影响（图2），对照组及LCA（10、20、40 μmol/L）处理组G1 期的细胞百分率分别为（23.53±0.50）%、（26.93±0.67）%、（27.70±1.97）%、（32.20±2.07）%。与对照组相比，LCA处理组细胞周期G1期的比例明显升高（P＜0.05），并呈现剂量依赖性，说明LCA可以使细胞阻滞在G1期。

图2 LCA对肺鳞癌H226细胞周期的影响Fig.2 Effect of LCA on cell cycle of H226 cells.A: Flow cytometry of H226 cells treated with different concentrations of LCA for 48 h.B:Quantitative analysis of the cell percentages in different phases(Mean±SD,n=3).*P＜0.05,**P＜0.01 vs control.

2.3 LCA对H226细胞中细胞周期相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，LCA可以降低细胞周期蛋白cyclinD1、CDΚ2以及CDΚ4的蛋白表达水平，CDΚ2的相对表达量从2.39降低到0.44，CDΚ4的相对表达量从2.14降低到0.17，同时cyclinD1的相对表达量从3.25降低到0.18，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 LCA对细胞周期蛋白CyclinD1及细胞周期蛋白依赖性激酶CDΚ2和CDΚ4表达的影响Fig.3 Effect of LCA on expressions of cyclin D1,CDK2 and CDK4 proteins in H226 cells detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).**P＜0.01 vs control.

2.4 LCA对Akt，p-Akt，PI3Κ以及p-PI3Κ蛋白表达的影响

通过Western blot检测PI3Κ和Akt的磷酸化水平，发现LCA 浓度依赖性的降低p-PI3Κ 和p-Akt 的磷酸化水平，p-PI3Κ的相对表达量从1.41降低到0.11，p-Akt的相对表达量从1.08降低到0.18，差异有统计学意义（P＜0.05，图4），但是对总的PI3Κ和Akt的表达无明显影响（P＞0.05，图4）。

图4 LCA对AΚT，p-AΚT，PI3Κ以及p-PI3Κ蛋白表达的影响Fig.4 Effect of LCAon expressions of Akt,p-AKT,PI3K and p-PI3K proteins in H226 cells detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).**P＜0.01 vs control.

2.5 LCA在体内抑制H226细胞增殖

裸鼠成瘤实验结果发现，与对照组小鼠相比，实验组小鼠在注射LCA后肿瘤体积明显缩小(图5A)。通过对生长曲线的分析发现，对照组小鼠的平均体积为1270.85 mm3，LCA处理组小鼠的平均体积为841 mm3，差异有统计学意义（P＜0.05，图5B），说明注射LCA后肿瘤体积明显受到抑制。通过解剖称量肿瘤的湿重，发现对照组小鼠的平均湿重为0.69，LCA处理组小鼠的平均湿重为0.46，差异有统计学意义（P＜0.01，图5C），LCA处理后肿瘤的质量明显降低（P＜0.01）。Western blot显示对照组中p-PI3Κ/PI3Κ 蛋白的相对表达量为0.95，LCA处理组为0.24，对照组中p-AΚT/AΚT蛋白的相对表达量为0.59，LCA处理组为0.19，差异有统计学意义（P＜0.05，图5D、E）。

图5 LCA体内抑制H226肿瘤生长Fig.5 LCA suppresses growth of H226 xenografts in mice.A: Representative image of the tumors.B:Average tumor volume(mm3).C:Weight of wet tumor.D,E:Expressions of Akt,p-AKT,PI3K and p-PI3K protein in tumor xenograft tissues measured by Western blotting.Data are presented as Mean±SD(n=4).*P＜0.05 vs control.

3 讨论

甘草查尔酮A是一种常见的具有抗炎和抗菌作用的天然药物，既往研究发现其在体内外具有很好的抗肿瘤作用，作用机制主要与抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡相关，但是在肺鳞癌中的作用尚未见报道。在本研究中，我们通过体内外实验探究甘草查尔酮A对肺鳞癌增殖的影响及可能的机制。MTT结果表明，随着LCA浓度的升高，肺鳞癌H226细胞活力呈剂量依赖性降低，说明LCA可以抑制H226细胞增殖。裸鼠荷瘤实验结果显示，LCA腹腔注射后，肿瘤的体积和重量都明显减小，说明LCA从体内水平抑制了H226细胞的增殖。

细胞癌变与细胞周期的关系是近年来关注的焦点，通过调节细胞周期来抑制癌细胞的增殖是癌症治疗的一个重要策略。研究表明LCA不仅能抑制肿瘤细胞的增殖［23］，还能诱导细胞周期阻滞［13,24］。为了进一步揭示LCA在肺鳞癌中的作用机制，本实验通过流式细胞术检测其对细胞周期的影响，结果表明，LCA处理H226细胞48 h后，G1期细胞数量明显增多，且呈剂量依赖性。说明LCA可引起细胞周期G1期阻滞。细胞周期中大多数与细胞增殖相关的基因事件发生在G1期，因此G1/S期过渡在细胞周期进程中起到非常重要的作用。细胞周期调控蛋白如CyclinD1［25］以及相关的细胞周期调控蛋白激酶CDΚ2及CDΚ4是细胞周期进程中从G1期进入S期非常重要的蛋白［26］，因此，我们通过Western blot探究了不同浓度LCA对CyclinD1、CDΚ2及CDΚ4 的表达的影响，结果显示，LCA 可以下调cyclinD1、CDΚ2及CDΚ4的表达，且呈浓度依赖性。

PI3Κ可参与调控细胞增殖、凋亡、转录和血管发生等多种细胞过程［27］，AΚT是PI3Κ的主要下游效应因子，可被PI3Κ激活，并磷酸化多种酶、激酶和转录因子［28］。有文献证明，PI3Κ/AΚT信号通路通过影响细胞周期相关分子来调节细胞周期进程［29,30］。而且研究还发现，许多药物都可以通过靶向PI3Κ/AΚT信号通路发挥抗肿瘤作用［31-33］。为了进一步探究LCA对肺鳞癌H226细胞的抑制作用是否通过靶向PI3Κ/AΚT信号通路，我们研究了不同浓度LCA对p-PI3Κ、PI3Κ、p-AΚT、AΚT表达的影响，Western blot的结果显示，PI3Κ和AΚT的表达几乎无变化，而p-PI3Κ和p-AΚT的表达明显降低，且呈浓度依赖性，这个结果表明，LCA抑制细胞增殖和诱导周期阻滞的作用可能与抑制PI3Κ/AΚT信号通路磷酸化有关。

本研究发现，LCA可以有效的抑制H226细胞增殖并诱导细胞周期阻滞，并引起细胞周期蛋白cyclinD1和细胞周期蛋白依赖性激酶CDΚ2和CDΚ4表达降低。裸鼠荷瘤实验也表明LCA可以在体内抑制肺鳞癌的生长。其作用机制可能与抑制PI3Κ/AΚT信号通路磷酸化有关。本研究初步揭示了LCA作为抗肺鳞癌治疗药物的可能作用机制，为LCA将来用于肺鳞癌的治疗提供了理论和实验依据。