王卫国，王伟伟，冯玉虎

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是发生于淋巴系前体细胞的恶性肿瘤，从免疫表型上可分为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)。白血病相关免疫表型是相关基因表达异常的表观特征之一，对ALL的诊断、治疗后的监测和预后判断上都有极其重要的价值[1-2]。CD304是一种非酪氨酸激酶的跨膜C型凝集素，是血管内皮生长因子共受体，参与神经元引导和血管生成，可在浆细胞样树突细胞、内皮细胞和多种实体瘤上表达，CD304异常表达对诊断母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤具有重要价值[3-4]。目前，CD304在ALL中表达和应用价值国内尚未发现相关文献报道，本研究通过对ALL细胞CD304表达进行分析，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年7月至2020年8月我院诊断的ALL病人37例，其中B-ALL病人32例，T-ALL病人5例。ALL的诊疗依据《成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(2016年版)》[5]。选取10例良性血液病作为对照：5例缺铁性贫血、5例巨幼细胞性贫血病人，检测骨髓中前体B细胞CD304的表达。

1.2 试剂和仪器 CD117、CD33、CD7、CD19、CD10、CD34、CD9、CD200、CD15、CD13、CD56、CD123、CD38、CD66c、CD5、CD22、Cu和CD79a荧光标记单克隆抗体、溶血剂、鞘液、FACSCalibur流式细胞仪(FCM)均购自BD Biosciences公司，藻红蛋白标记CD304购自DAKO公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫表型的检测 抽取骨髓2 mL，计数后调整细胞浓度为(10～20)×109/L，采用四色抗体组合。胞质抗原需要对细胞固定、破膜，胞膜抗原的检测：每管加入标本25 μL，分别加入相应量的抗体，避光染色15 min，每管加入2 mL溶血剂溶血10 min，离心后弃上清，加入300 μL磷酸盐缓冲液上机检测，Cellquest软件分析。对照组采用CD10/CD304/CD45/CD19组合检测B祖细胞上CD304的表达。抗原表达≥20%为阳性，抗原表达<20%为阴性，阳性率≥50%为强阳性，<50%为弱阳性[6]。

1.3.2 CD304和BCR-ABL共阳性ALL病人微小残留病(minimal residual disease，MRD)检测 为评估CD304在MRD检测中的价值，选择本研究中阳性频次较多的BCR-ABL和CD304共阳性的样本，利用FCM和PCR(通过15189认证第3方分子实验室)检测。选取21份样本，BCR-ABL融合基因采用实时定量PCR方法(最低检出限为1/105)，FCM法采用包括CD304的四色组合，至少收集20万个细胞(最低检出限为1/104)。

1.4 统计学方法 采用t(或t′)检验、χ2检验和Fisher′s确切概率法。

2 结果

2.1 B-ALL病人一般临床资料比较 BCR-ABL1阳性病人CD304表达阳性率高于E2A-PBX1和融合基因阴性病人(P<0.05)；CD304阴性和阳性B-ALL病人的性别、年龄、白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)和血小板计数(PLT)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 B-ALL细胞CD304表达 5例T-ALL细胞和10例对照者B细胞上均不表达CD304，B-ALL病人43.75%(14/32)表达CD304：10例BCR-ABL阳性(12例)、1例TEL-AML1阳性和3例融合基因阴性(14例)病人CD304阳性表达，而3例E2A-PBX1阳性和2例MLL/AF4阳性病人CD304阴性表达。CD304表达模式见图1。

表1 B-ALL病人一般临床资料比较

2.3 CD304阴、阳表达的B-ALL细胞其他相关CD分子阳性频率比较 与CD304阴性比较，CD304阳性病人B-ALL细胞CD66c表达频率升高(P<0.01)(见表2)。

2.4 FCM与PCR检测MRD符合率 共检测了21份样本MRD，PCR阳性11份，FCM阳性10份，共阳性10份，阳性符合率为91%，阴性符合率91%，总符合率为95%。

表2 CD304阴、阳性表达的B-ALL白血病相关CD阳性频率比较(n)

3 讨论

免疫表型对白血病类型的诊断极其重要，发现ALL细胞异常表达的抗原，对诊断和鉴别诊断价值极高。CD304对于ALL细胞是一种跨系抗原，本次实验发现B-ALL中CD304阳性率为43.75%(14/32)，这与国外相关文献报道的阳性率相当[7-8]，而T-ALL和其他非ALL的对照者的B细胞中均未发现阳性表达，提示CD304的阳性表达对B-ALL白血病母细胞具有较高的特异性。B-ALL不同融合基因阳性的细胞抗原表达谱存在差异，如BCR-ABL阳性常表达CD13、CD25、CD66c，TEL-AML1阳性不或弱表达CD9、CD20，MLL基因重排阳性常表达NG2、CD15[9-10]。本研究发现12例BCR-ABL融合基因阳性病人中有10例CD304阳性，1例TEL-AML1阳性病人表达CD304，而3例E2A-PBX1和2例MLL阳性病人不表达CD304，BCR-ABL融合基因阳性病人存在较高的阳性率。MEYERSON等也报道10例Ph+阳性B-ALL有9例表达CD304[11]，GUDAPATI等的研究也支持这种结果。SOLLY等[12]报道27例TEL-AML1均表达CD304[12]，CD304表达与TEL-AML1(ETV6-RUNX1)融合基因呈正相关,而与TCF3-PBX1(E2A-PBX1)融合基因呈负相关[7]，本次检测结果虽然数量较少，但佐证了上述报道结果，提示CD304在B-ALL中表达与否与其他抗原一起对融合基因的预判具有一定价值，也发现14例融合基因阴性病人中有3例表达CD304，提示CD304的异常表达在B-ALL有一定的广泛性和异质性。分析B-ALL中其他抗原表达，发现CD304阳性白血病细胞CD66c表达阳性频率增加，这与本次样本中BCR-ABL阳性比例较高有关[13]。单一免疫表型与白血病预后的关系一直存在争议，虽然有报道认为CD304表达是B-ALL预后不良因素[14]，但在预后较差的E2A-PBX1、MLL融合基因阳性病人出现频率较低[7-8,11-12]，说明CD304的表达与B-ALL预后的关系尚需进一步研究，尤其是新药时代下BCR-ABL阳性的ALL的疗效已发生明显变化[15]。

由于FCM评估MRD优势比较明显，经济、便捷、样品易得，新的免疫标记可以提高流式细胞仪监测MRD的适用性和准确性。区分性好的跨系对MRD的准确测定价值很高，虽然抗原表达的荧光强度是判断标准之一，但由于抗体比例不当或该特定通道的电压较低，易导致表达水平降低的误判。我们对本次研究中融合基因阳性并表达CD304的病人进行MRD检测结果比较，结果显示利用CD304标记的FCM法与PCR法具有较好的符合率，其中有1例PCR结果阳性而FCM阴性，可能是因为本实验FCM不是二代流式，其检测结果的灵敏度没有PCR高。

总之，虽然本次是小样本量的研究，但结果显示CD304是一种在B-ALL病人中表达频率较高，具有较好的临床价值，利用CD304检测适用病人的MRD是一种较好的选择。