刘迪迪，陆 莉，杨燕青，王凤超

NLRP3炎症小体是一个多聚蛋白复合物，由NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白组成，可识别病原微生物和多种危险信号[1-2]。其活化后介导炎性细胞因子，如白细胞介素(IL)-1β、IL-18的成熟与分泌，在抗感染免疫和多种人类炎性相关疾病，如痛风、2型糖尿病、阿尔茨海默病等中发挥重要作用[3-4]。目前，NLRP3炎症小体相关炎性疾病的治疗策略主要针对NLRP3炎症小体活化后的产物如IL-1β，但此方法无法治疗NLRP3炎症小体活化后IL-18分泌和细胞焦亡导致的疾病，且易影响细胞其他生理功能，存在较多弊端[5]。靶向抑制NLRP3炎症小体活化成为治疗相关炎性疾病的新策略，多种NLRP3炎症小体抑制剂表现出良好效果[6-9]，但还难以应用于临床。桑黄酮是具有抗炎抗氧化中草药桑枝中的主要活性成分，已被证实在神经炎症上有明显抑制作用[10-11]，但其能否抑制NLRP3炎症小体活化并缓解相关炎性疾病有待证明。本文旨在探究桑黄酮对NLRP3炎症小体活化及其相关炎性疾病的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞系 SPF级C57BL/6(B6)雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。造模时体质量22～24 g，鼠龄7～10周，在无特定病原体(SPF)条件下饲养。人急性单核细胞白血病THP-1细胞系，受赠于蚌埠医学院汪洪涛教授课题组。本研究经蚌埠医学院伦理委员会审核批准(审批号：伦动科批字[2020]第057号)。

1.2 药品及主要试剂 桑黄酮(Mul，上海陶素生化公司，货号：TQ0161)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(中国novoprotein公司，货号：CB34)、PMA(SIGMA公司，货号：79346)、脂多糖(LPS)(Invivogen公司，货号：tlrl-eklps)、尼日利亚菌素(Nigericin ，SIGMA公司，货号：N7143)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)(SIGMA公司，货号：A2383)、红细胞裂解液(碧云天公司，货号：C3702)、PBS(Servicebio公司，货号：G0002)、DMEM细胞培养基(Gibco公司，货号：C11965500BT)、RPMI 1640培养基(Gibco公司，货号：C11875500BT)、ELISA试剂盒[小鼠IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)、人IL-1β ELISA kit，购自R&D公司]、Western blotting抗体[抗小鼠Caspase-1(p20)，购自AdipoGen公司；抗人Caspase-1(p20)，购自CST公司；β-actin抗体，为Abmart公司产品；山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG，购自Jackson IR公司]。

1.3 仪器 Thermo3543 CO2培养箱(美国ThermoFisher)；Western blotting电泳转膜槽(美国BIO-RAD)；ChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像仪(美国BIO-RAD)；SCI100MiniH恒温金属浴(中国SCILOGEX)；CH20 BIMF200倒置显微成像仪(日本OLYMPUS)；MultiskanSky多功能酶标仪(美国ThermoFisher)；5810R大容量低温离心机(德国eppendorf)；D3024R控温离心机(中国SCILOGEX)。

1.4 方法

1.4.1 药物及试剂的配制 桑黄酮25 mg，溶于DMSO，配制为50 mmol/L贮存液，分装冻存于-80 ℃冰箱，动物实验时用PBS稀释桑黄酮贮存液，按照25 mg/kg体质量的剂量，每只鼠腹腔注射0.2 mL。单钠尿酸盐(MSU)制备：每1.68 g粉末溶于500 mL的0.01 mol/L NaOH溶液中，加热至70 ℃溶解，0.22 μm滤器过滤后室温下使MSU晶体重新析出。再用无水乙醇洗晶体并高压灭菌后烘干，无菌PBS重悬晶体至50 μg/μL，并用超声仪震荡过夜，显微镜下观察MSU晶体大小并确认其可以进入细胞，分装冻存于-20 ℃冰箱。LPS：溶于无菌PBS，配置为5 mg/mL贮存液，分装冻存于-80 ℃冰箱，动物实验时用PBS稀释，按照20 mg/kg体质量的剂量，每只鼠腹腔注射0.3 mL。

1.4.2 细胞刺激前分化 麻醉下处死小鼠取小鼠后腿，无菌分离腿骨骨髓细胞。加入M-CSF(50 ng/mL)，37 ℃细胞培养箱分化5～7 d。培养皿内贴壁细胞即为实验所需骨髓来源巨噬细胞(BMDM)。人THP-1细胞，加入PMA(400 ng/mL)培养过夜，使得原始THP-1细胞分化为可实验用巨噬细胞。

1.4.3 NLRP3炎症小体刺激 已分化的BMDM或THP-1细胞，转入细胞培养板中，37 ℃培养箱培养过夜。加入LPS(100 ng/mL)预刺激3 h，加入桑黄酮30 min后，分别加入不同的NLRP3炎症小体激动剂刺激相应时间(Nigericin、ATP刺激约30 min，MSU刺激约3 h)，收集细胞培养上清至EP管中待用，向12孔细胞培养板内加入细胞裂解液，裂解5 min，转入EP管中待用。

1.4.4 Western blotting 细胞上清需利用甲醇和氯仿抽提蛋白，最后加入上样缓冲液裂解；细胞直接用上样缓冲液裂解。裂解液金属浴101 ℃煮10 min，后经过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5% BSA封闭1 h，一抗caspase-1(p20)(1∶1 000稀释)，4 ℃摇床过夜，PBST洗3次，相应HRP标记二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h，PBST洗3次，加底物显色，并用化学发光成像仪曝光拍照。

1.4.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6以及小鼠腹腔液及血清中IL-1β及TNF-α表达水平 按试剂盒说明书在96孔ELISA板中进行，PBS稀释包被抗体(1∶200稀释)室温过夜孵育，PBST洗3次，10%血清封闭1 h，PBST洗3次，加入标准品和样品室温孵育2 h，PBST洗3次，检测抗体(1∶100稀释)孵育1 h，PBST洗3次，HRP(1∶50稀释)孵育30 min，PBST洗5次，加入底物显色，10%硫酸终止，酶标仪在450 nm读数。根据标准曲线计算样品中细胞因子浓度。

1.4.6 模型制备与给药 SPF级C57BL/6小鼠饲养至7～10周，小鼠体质量约22～24 g，称量体质量。(1)随机分为安慰剂组(PBS组)(3只)、感染性休克组(LPS组)(6只)、桑黄酮干预组(LPS+Mul组)(6只)，桑黄酮干预组提前1 h腹腔注射桑黄酮溶液0.2 mL，剂量50 mg/kg体质量，再对LPS组和LPS+Mul组同时腹腔注射LPS(20 mg/kg)溶液0.3 mL。LPS注射4 h后，眼球取血，分离血清，颈椎脱臼处死小鼠并收集灌洗液。(2)随机分为安慰剂组(PBS组)(5只)、感染性休克组(LPS组)(10只)、桑黄酮干预组(LPS+Mul组)(10只)，桑黄酮干预组腹腔注射桑黄酮溶液0.2 mL(50 mg/kg)，1 h后，感染性休克组和桑黄酮干预组同时腹腔注射0.3 mL LPS(20 mg/kg)。观察并记录小鼠生存时间。

1.4.7 小鼠腹腔灌洗液收集 处死小鼠，剪开小鼠腹部外皮，用1 mL胰岛素注射针注射1 mL无菌PBS入小鼠腹腔，用手指对小鼠腹部进行2 min按摩，用25 G针头配合1 mL注射器管，吸出腹腔液，离心，上清用于ELISA检测。

1.5 统计学方法 采用t检验和生存曲线分析(Log-Rank检验)。

2 结果

2.1 桑黄酮抑制尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体的活化 Western blotting及ELISA结果显示，桑黄酮可剂量依赖地抑制尼日利亚菌素诱导的Caspase-1(p20)表达及IL-1β的分泌(P<0.01)(见图1、表1)，但非炎症小体相关的细胞因子TNF-α和IL-6分泌差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表1 桑黄酮对Nigericin刺激的BMDM细胞IL-1β表达的影响

表2 桑黄酮对Nigericin刺激的BMDM细胞TNF-α和IL-6表达的影响

2.2 桑黄酮抑制多种刺激剂诱导的NLRP3炎症小体的活化 除Nigericin外，多种病原菌和危险信号均可引起NLRP3炎症小体活化如MSU、ATP等。结果显示桑黄酮明显抑制Nigericin、ATP及MSU三种经典的NLRP3炎症小体激动剂所诱导的Caspase-1(p20)表达及IL-1β分泌(P<0.01)(见图2、表3)。

表3 桑黄酮对多种刺激剂活化的BMDM细胞IL-1β表达的影响

2.3 桑黄酮抑制人THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活化 为了明确桑黄酮在人THP-1细胞中是否同样抑制NLRP3炎症小体的活化，利用Nigericin刺激分化后的人THP-1细胞进行实验，结果显示桑黄酮可以剂量依赖性地抑制Caspase-1(p20)表达及IL-1β分泌(P<0.01)(见图3、表4)。

表4 桑黄酮对Nigericin刺激的THP-1细胞IL-1β表达的影响

2.4 桑黄酮缓解LPS诱导的小鼠感染性休克 在小鼠感染性休克模型中进一步验证桑黄酮在动物水平上的作用，ELISA检测小鼠血清及腹腔灌洗液IL-1β及TNF-α表达水平，结果表明，与LPS组相比，LPS+Mul组小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β分泌明显降低(P<0.01)，而TNF-α的水平差异无统计学意义(见表5)。除此之外，观察LPS注射后84 h内小鼠生存状态，并绘制生存曲线，结果显示LPS组小鼠14 h开始死亡，36 h小鼠死亡率达80%。而LPS+Mul组小鼠64 h开始死亡，72 h小鼠死亡率为40%(P<0.01)(见图4)。

表5 桑黄酮对感染性休克小鼠血清及腹腔灌洗液IL-1β及TNF-α的影响

3 讨论

桑枝为桑科桑属植物桑的干燥嫩枝，主治风湿痹痛，水肿脚气，另有报道桑枝还具有抗炎、抗氧化及抑菌抗病毒等功效[12-14]。桑黄酮作为桑枝的主要活性成分，现有研究主要集中在神经炎症、脂质代谢等方面，有研究[15]发现其通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制神经炎症帕金森综合征；另有研究[16]发现桑黄酮可通过调节脂质代谢关键酶来降低肥胖的发生率。帕金森综合征和肥胖的发生发展与NLRP3炎症小体的异常活化密切相关[17-18]。目前，桑黄酮对NLRP3炎症小体作用尚不清楚，因此，探究其是否通过调节NLRP3炎症小体发挥抗炎作用对明确桑黄酮的抗炎机制具有重要意义。

NLRP3炎症小体在炎性疾病中发挥重要作用，使其成为治疗相关疾病的关键靶点。近年来，越来越多的小分子化合物被报道可以抑制NLRP3炎症小体活化，多种中草药成分被证实对抑制NLRP3炎症小体活化具有良好效果[19-21]，但还难以应用于临床。寻找可靠的NLRP3炎症小体抑制剂成为新的研究方向[22]。因此，本研究主要探究中草药抗炎成分桑黄酮的抗炎作用是否通过抑制NLRP3炎症小体活化来实现。我们首先在体外探究桑黄酮是否抑制NLRP3炎症小体活化，结果显示，桑黄酮在鼠BMDM细胞中抑制Caspase-1表达及IL-1β分泌，但对primming信号介导的TNF-α和IL-6的产生没有影响，证实了桑黄酮以剂量依赖性地方式抑制Nigericin诱导的NLRP3炎症小体活化。同时，除Nigericin外，NLRP3炎症小体还可被内源性DAMPs及多种病原菌激活[23]。本研究也发现桑黄酮可以抑制其他NLRP3炎症小体刺激剂(如MSU和ATP)诱导的炎症小体活化，表明桑黄酮抑制NLRP3炎症小体具有广谱性。以上结果证实了桑黄酮可抑制鼠BMDM细胞中NLRP3炎症小体的活化。接下来笔者探讨桑黄酮在人THP-1细胞中是否抑制NLRP3炎症小体活化，结果显示，桑黄酮显著抑制Caspase-1表达及IL-1β分泌，证实了桑黄酮在人THP-1细胞中同样可以抑制NLRP3炎症小体活化。

NLRP3炎症小体的异常活化会导致大量炎性因子释放，诱导多种炎症性疾病发生，如肝纤维化[24]、炎症性肠病[25]及感染性休克[26]等。严重的感染性休克是内、外科重症监护病房中最常见的死亡原因，也是临床上亟待解决的问题之一[27]。我们构建了最常见的感染性休克模型——小鼠腹腔注射LPS，研究结果显示，桑黄酮可以明显抑制感染性休克小鼠血清和腹腔灌洗液中NLRP3炎症小体依赖的IL-1β的产生，但对NF-κB信号通路介导的TNF-α无影响。表明桑黄酮通过抑制NLRP3炎症小体活化缓解小鼠急性炎症。此外，观察LPS腹腔注射84 h内小鼠生存状态发现，LPS造模组小鼠14 h后开始死亡，而桑黄酮治疗组小鼠64 h开始死亡，桑黄酮显著延长了感染性休克小鼠的生存时间。这些结果表明桑黄酮通过抑制NLRP3炎症小体激活，在体内减轻了LPS诱导的感染性休克。

综上所述，桑黄酮不仅可以抑制体外鼠BMDM和人THP-1细胞NLRP3炎症小体活化，还可以阻抑体内NLRP3炎症小体激活，进而减轻炎症反应。明确桑黄酮对NLRP3炎症小体相关疾病的治疗作用，对开发其药用价值及推进临床应用具有重要意义。