黄艺飞，尹延哲，邵忠林，张伟平，胡荣雪，佟颖，2

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040

尿酸性肾病（uric acid nephropathy，UAN）是由高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）导致尿酸盐结晶在肾脏沉积过多，引起肾脏受损的一类疾病[1]。UAN临床表现以蛋白尿、水肿、少尿、高血压、高尿酸等为特征[2]。HUA在全球的高发病率给社会带来巨大的健康和经济负担[1]。

中医治疗UAN在保护肾功能、改善肾损害方面有显著优势[3]。土茯苓有清热利湿、通利关节功效，可用于治疗湿热壅毒引起的疾病，其主要化学成分黄酮类可抑制黄嘌呤氧化酶活性，减少尿酸生成[4]。车前子具有清热、平肝、明目、利水功效，用于治疗尿频尿急、目赤肿痛、痛风等疾病[5]。研究显示，车前子能抑制嘌呤酶，减少尿酸生成[6]。土茯苓、车前子能下调高尿酸大鼠肾脏尿酸转运蛋白1 mRNA表达，促进尿酸排泄，从而改善HUA[7]。本研究通过网络药理学及分子对接方法，探究土茯苓-车前子干预UAN的可能机制，以期为中医治疗UAN提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 土茯苓-车前子活性成分及靶点筛选

利用TCMSP（https://tcmsp-e.com/）分别检索土茯苓、车前子化学成分，根据口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件筛选活性成分，通过TCMSP检索活性成分对应靶点。

1.2 疾病靶点筛选

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库，以“uric acid nephropathy”为关键词检索疾病相关靶点，利用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）对药物靶点与疾病靶点名称进行校正并转化为基因名称。

1.3 交集靶点获取

利用WPS Office Execl 11.1将药物靶点与疾病靶点取交集，交集靶点即土茯苓-车前子干预UAN的潜在靶点。

1.4 蛋白相互作用网络构建

将交集靶点导入STRING11.0 数据库（https://string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，置信度＞0.4，隐藏网络中游离靶点，构建蛋白相互作用（PPI）网络，保存为tsv文件。利用Cytoscape3.7.2的CytoNCA 插件计算网络中各节点的拓扑参数，构建PPI核心网络。

1.5 活性成分-靶点网络构建

利用Cytoscape3.7.2软件绘制活性成分-靶点网络，利用CytoNCA插件对网络进行分析，得到干预UAN的主要活性成分及作用靶点。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P＜0.05为筛选条件，将结果导入R软件，进行可视化处理。

1.7 活性成分与核心靶点分子对接

利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载药物活性成分2D结构，再通过Chem3D软件把2D结构转化为3D结构。利用RCSB Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的3D结构，筛选条件：①蛋白结构来源于人；②构象分辨率＜2.5 Å；③蛋白构象序列完整且有小分子配体；④结晶pH值接近人体生理范围。利用AMDock1.0软件对主要活性成分与核心靶点进行分子对接，使用PyMol软件对结果进行可视化。

2 结果

2.1 土茯苓-车前子活性成分及靶点获取

通过TCMSP检索获得土茯苓活性成分15个，车前子活性成分9个，二者共同成分2个，见表1。通过TCMSP 检索对应靶点，去除重复后共获得靶点309个。

表1 土茯苓-车前子活性成分信息

2.2 疾病靶点与交集靶点获取

通过GeneCards、OMIM、TTD数据库分别获得疾病靶点975、556、0个，剔除重复靶点后获得UAN相关靶点1 512个。

将土茯苓-车前子作用靶点与疾病靶点取交集，经UniProt校对后得到59个共有靶点，即土茯苓-车前子干预UAN的交集靶点。

2.3 蛋白相互作用网络

将59个交集靶点导入STRING11.0数据库构建PPI网络，见图1。该网络有56个靶点和427条边。筛选拓扑参数均大于中位数的靶点，将大于度值中位数2倍的靶点作为核心靶点，得到核心靶点7个，分别为IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3，以此为基础建立PPI网络，见图2。

图1 土茯苓-车前子干预UAN交集靶点PPI网络

图2 土茯苓-车前子干预UAN核心靶点PPI网络

2.4 活性成分-靶点网络

利用Cytoscape3.7.2软件绘制土茯苓-车前子活性成分-靶点网络，该网络有78 个节点，包括槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、柚皮素（naringenin）等19 个活性成分，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）等59个靶点，通过139条边连接，见图3。通过CytoNCA插件计算，筛选出大于度值中位数2倍的6个活性成分，见表2。

表2 土茯苓-车前子干预UAN主要活性成分拓扑分析

图3 土茯苓-车前子活性成分-靶点网络

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析结果

对59个交集靶点进行GO功能分析，以P＜0.05为筛选条件，得到生物过程（BP）238个，包括细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）、基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）、炎症反应（inflammatory response）、细胞迁移的正调控（positive regulation of cell migration）、老化（aging）等；细胞组分（CC）39个，包括质膜（plasma membrane）、细胞外间隙（extracellular space）、胞外区（extracellular region）、大分子复合物（macromolecular complex）、内质网内腔（endoplasmic reticulum lumen）等；分子功能（MF）46 个，包括相同蛋白结合（identical protein binding）、酶结合（enzyme binding）、丝氨酸型内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、血红素结合（heme binding）、神经递质受体活性（neurotransmitter receptor activity）等。以P值升序排序，取各项前10位用R软件绘制气泡图，见图4～图6。

图4 土茯苓-车前子干预UAN靶点GO-BP富集分析

图5 土茯苓-车前子干预UAN靶点GO-CC富集分析

图6 土茯苓-车前子干预UAN靶点GO-MF富集分析

KEGG富集分析得到84个相关通路，以P值升序排列，取前10 位信号通路用R 软件绘制气泡图，见图7。主要作用于癌症通路（Pathways in cancer）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的糖基化终末产物及其受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。

图7 土茯苓-车前子干预UAN靶点KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果

将主要活性成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素与4个核心靶点IL6、TNF、PPARG、TP53分别进行分子对接。一般认为，结合能＜-5 kcal/mol表明成分与靶点有较强的结合活性，若＜-7 kcal/mol则提示有强烈结合活性[8]。运用AMDock1.0软件进行分子对接，结果显示，各成分与靶点均具有较强结合活性，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素与PPARG具有强烈结合活性，见表3。另外，选取槲皮素与4个靶点进行对接可视化分析，发现槲皮素与IL6 的ARG167、SER175、PRO64残基形成氢键，与TNF的GLN125、LEU93、ARG82 残基形成氢键，与PPARG 的CYS432、ILE268残基形成氢键，与TP53的GLN19、HIS73、LYS69残基形成氢键，见图8。

表3 核心靶点与主要活性成分分子对接平均结合能（kcal/mol）

图8 槲皮素与核心靶点分子对接模式

3 讨论

根据临床症状，UAN 属中医学“痹证”“腰痛”“历节”等范畴。《素问·痹论篇》有“风寒湿三气杂至，合而为痹”，《灵枢·经脉》云：“足少阴之别……虚则腰痛。”UAN病机为正气亏虚，肝脾肾受损，湿、痰、瘀等邪久积体内，属本虚标实之证，病位在肾，与肺、肝、脾等脏有关。根据其基本病机，应以健脾益肾、利湿泄浊、活血化瘀为基本治法[3]。土茯苓味甘、淡，性平，归肝、胃经，可除湿解毒、通利关节。车前子味甘、性寒，入肾、膀胱经，可利水通淋、渗湿止泻。土茯苓、车前子能入肝肾，泄湿浊，符合UAN基本治法。

本研究运用网络药理学方法，从土茯苓-车前子中筛选出22个干预UAN的活性成分，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、柚皮素等可能在UAN发生发展过程中起重要作用。槲皮素可通过调节大鼠肾组织有机阴离子转运蛋白3、多药耐药相关蛋白4、乳腺癌耐药蛋白和多药及毒性化合物外排转运蛋白1水平，增加尿酸排泄，降低血尿酸水平，从而改善UAN 造成的肾损伤[9]。此外，槲皮素可调节转化生长因子-β1、环氧化酶-2、核因子-κB水平和半胱氨酸酶-3、Bcl-2表达，调节肝肾毒性，改善肝肾组织病理变化，恢复细胞抗氧化能力[10]。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，能通过降低趋化因子和炎症因子表达发挥降低胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌和抗癌等作用[11]。其抗炎机制主要是抑制TLR4/NF-κB、NLRP3、STAT 和MAPK等信号通路[12]。豆甾醇具有抗炎、抗肿瘤等生物活性，通过影响MAPK3和PRKACA调控细胞因子表达，起到抗炎作用[13]。Kishore等[14]发现，豆甾醇可能通过减少AGEs形成和改善氧化应激，影响糖尿病肾病进展。根据β-谷甾醇和豆甾醇在抗炎方面的作用，我们推测，其可能通过干预UAN引起的炎症反应，从而改善高尿酸引起的肾损害。柚皮素对促炎因子和抗炎因子都有一定调节作用，可降低血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平，进而降低血尿素氮、血肌酐、血尿酸水平，改善四氯化碳诱导的大鼠肝肾损伤[15]。

PPI 网络分析发现，IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3靶点可能在土茯苓-车前子干预UAN过程中起重要作用。白细胞介素（IL）-6是一种促炎因子，可激活其他细胞释放血管内皮因子，减少中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白分泌，抑制肾脏炎症和纤维化，从而改善慢性UAN肾损伤[16]。调节IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平可改善肾脏损伤，对UAN起到保护作用[17]。PPAR-γ是一种转录因子，参与炎症反应和纤维化，PPAR-γ通路能调节内皮性一氧化氮合酶表达，保护缺血再灌注引起的急性肾损伤，减轻肾脏氧化应激、炎症和纤维化[18]。Awad等[19]发现，降低肾组织TP53表达可减缓肾脏纤维化，保护肾功能。Ye等[20]发现，调节PTGS2蛋白及mRNA表达可抑制炎症，从而减轻尿酸盐结晶引起的痛风性关节炎。

GO富集分析发现，土茯苓-车前子干预UAN的生物过程包括细胞因子介导的信号通路、基因表达的调控、炎症反应及细胞迁移等，分子功能主要涉及相同蛋白结合、丝氨酸型内肽酶活性及酶结合等。KEGG富集分析发现，AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路排名靠前。AGE-RAGE/NF-κB通路激活与肾脏保护有关，且在肝脏与肾脏纤维化组织中更明显[21]。Li等[22]研究表明，激活IL-17信号通路可缓解白色念球菌诱导的BALB/c小鼠肾脏炎症。

综上，土茯苓-车前子可能通过调控IL6、TNF、PPARG、TP53、IL1B、PTGS2、NOS3等靶点及AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路，影响肝、肾细胞生物活性，干预UAN。本研究为中医药治疗UAN提供理论依据，但网络药理学属于理论研究，一方面受限于数据库的时效性，另一方面需要更进一步的实验进行验证。