颜晓钰，司 玥，邢 翔

(山东大学威海海洋学院，山东威海 264209)

嗜高温菌分裂周期短、代谢速率快、生长率高、适应性强，被广泛应用于环境保护、能源利用、石油开采、液体燃料生产、生物转化及抗生素生产等领域。利用高温菌进行工业发酵，可以缩短生产周期、避免微生物感染，在食品等行业中具有广泛应用前景[1]。在食品工业中甘油常用作甜味剂、烟草剂的吸湿剂和溶剂等，其主要生产方式还是化学合成法或使用天然油脂进行皂化反应[2-3]，发酵法虽已有应用，但多为酵母等真菌发酵[4]。本研究在获得嗜高温细菌后，对其进行形态学观察及生理生化鉴定等，确定了菌株的分类地位并鉴定其产甘油，通过对菌株发酵条件进行优化，提高了菌株的甘油产量，为细菌发酵生产甘油提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 在黑松的根系土壤中，分离得到嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus)。

1.1.2 试剂 琼脂粉、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、氯化铵，高碘酸钠、碘化钾、硫代硫酸钠、浓盐酸，试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。

1.1.3 培养基 LB培养基 胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g，蒸馏水溶解至1 000 mL，自然pH，121 ℃灭菌20 min。固体培养基加入1.8%～2.0%琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离纯化及筛选 将10 g土壤装入盛有200 mL LB液体培养基的500 mL锥形瓶，于55 ℃培养箱震荡培养48 h，得到菌株富集液。取菌悬液进行10-1～10-7梯度稀释，分别将100 μL稀释液用涂布棒均匀涂抹于LB固体培养基平板，55 ℃下恒温培养24 h，后多次进行划线纯化，筛选目标菌株。

1.2.2 菌株的形态学观察及生理生化鉴定 在自然光下观察菌落形态(大小、形状、颜色、边缘和透明度等)；取复壮后菌体进行革兰氏染色并镜检，观察菌落颜色和形态；同时，将菌体用戊二醛等溶液处理，进行透射电镜观察。依照《常见细菌系统鉴定手册》[5]进行生理生化测定。

1.2.3 菌株分子生物学鉴定 对菌株DNA进行提取并使用27F通用引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳验证后，送至华大基因科技公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行Blast相似性比对分析，使用MEGA软件中的NJ法构建系统发育树[6]。

1.2.4 菌株的生长曲线测定 取2 mL种子液接种到100 mL发酵培养基中，于55 ℃恒温培养箱震荡培养，采用紫外分光光度法[7]每隔3 h进行OD 60 nm测定，绘制24 h内以培养时间为横坐标、平均OD 600 nm为纵坐标的生长曲线。

1.2.5 菌株的最佳发酵条件确定 采用单因素轮换法依次考察不同碳源、温度、盐度、pH、接种量对菌株生长的影响，以获得最佳发酵条件。使用酶标仪[8]检测菌株在不同生长条件下的OD 600 nm，每组设置3个重复。

1.2.6 菌株在最适生长条件下的甘油产量 配制0.023 mol/L的高碘酸钠溶液、20%碘化钾溶液、0.05 mol/L的硫代硫酸钠溶液、20%盐酸溶液和淀粉指示剂，利用高碘酸-氧化法[9]对菌株在最佳生长条件下的甘油产量进行测定。

1.3 数据统计与分析

使用Excel、MEGA 7.0等软件对所得试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学观察及生理生化鉴定结果

菌落为圆形、乳白色，边缘透明不规则，表面光滑、湿润；通过革兰氏染色和光学显微镜观察发现，菌株被染为紫色，属革兰氏阳性菌，短小杆状，可见明显芽孢；透射电镜显示，菌株为长杆状，有鞭毛，胞外产物较多(图1、图2)。采用API 50CH试剂盒进行生理生化鉴定，由附表得知，发酵产物中有甘油产生且无影响甘油含量测定的糖类，可使用高碘酸-氧化法进行甘油测定。

图1 菌株形态观察

图2 菌株透射电镜照片

附表 生理生化鉴定结果

2.2 菌株分子生物学鉴定结果

菌株经PCR扩增后，均得到1 500 bp的基因序列片段，将测序后获得的基因序列在数据库进行序列对比，该菌株序列与Aneurinibacillusthermoaerophilus的16S rDNA 序列同源性高达99.87%，同时结合菌株的形态观察及生理生化鉴定结果，鉴定菌株为Aneurinibacillusthermoaerophilus，并编号为AneurinibacillusthermoaerophilusY4。同时构建系统发育树，显示菌株与Aneurinibacillusthermoaerophilus亲缘关系最近(图3)。

图3 菌株系统发育树

2.3 菌株的生长曲线

在摇床振荡培养的条件下，用紫外分光光度计测得菌株培养 0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 的OD 600nm，每个时间点设置3组平行。由图4生长曲线可知，菌株在0～6 h为生长延迟期，6～21 h为对数生长期，此后进入平台期，24 h后进入衰亡期。

图4 菌株生长曲线

2.4 菌株发酵条件优化

2.4.1 不同碳源对发酵的影响 取菌株种子液2 mL分别接种在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉为碳源的发酵培养基上，其他条件相同且适宜，50℃、120 r/min振荡培养24 h后使用酶标仪测定其OD值，以空白培养基作对照，比较不同碳源对发酵的影响，每个碳源设3个重复。通过图5可知，菌株在生长过程中，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉均被利用，但是葡萄糖更利于菌株的生长，获得最大菌株生长密度。依据试验结果可以推测葡萄糖是菌株生长的最佳碳源。

图5 碳源对菌株生长的影响

2.4.2 不同温度对菌株生长的影响 将2 mL种子液接种至发酵培养基中，控制发酵初始盐度、pH及其他发酵条件一致且适宜，改变发酵温度，分别于40、45、50、55、60 ℃温度下进行试验，以空白培养基作对照，探究最适发酵温度；每个温度设3个重复。当温度在45～60 ℃范围内，菌株均能生长，可说明菌株有较强的适应能力，但是温度在40 ℃时不利于菌株的生长。50 ℃时获得菌株生长最大密度，可以推测温度为50 ℃是菌株最佳生长温度且低于40 ℃不利于菌株的生长(图6)。

图6 不同温度对菌株生长的影响

2.4.3 不同盐度对菌株生长的影响 将2 mL种子液接种至发酵培养基中，控制发酵温度、pH及其他发酵条件一致且适宜，改变发酵时菌剂所处环境的盐浓度，分别按照2.5‰、5‰、10‰、15‰、20‰盐浓度进行试验，以空白培养基作对照，探究最适发酵盐浓度。每个盐浓度设3个重复。当盐度为5%～15%时，随着盐度的升高，菌株密度不断增大；但是当盐度高于15%时，随着盐度的升高，菌株的发酵减弱，可能是因为高浓度的盐浓度影响降解细菌细胞的渗透压，严重者可导致菌体裂解死亡。当盐浓度在10‰～20‰时，菌株发酵均良好，可推测菌剂发酵的最佳的盐浓度为15‰(图7)。

图7 不同盐度对菌株生长的影响

2.4.4 不同pH对菌株生长的影响 在控制温度、盐度及其他发酵条件一致且适宜的条件下，将2 mL种子液分别接种在pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培养基上，50℃、120 r/min振荡培养24 h后测定其降解效能，以空白培养基对照，比较不同pH值对发酵的影响；每个pH设3个重复。当pH 值为5或9时，菌株几乎不发酵；而当pH值在6～8时，菌株发酵随着pH值趋向中性而增强，可见菌株的发酵与环境pH有很大的相关性，可推测趋近中性的环境更利于菌株发酵且pH值为7时是菌剂的最佳发酵条件(图8)。

图8 不同pH对菌株生长的影响

2.4.5 不同接种量对菌株生长的影响 在控制温度、盐度及其他发酵条件一致且适宜的条件下，改变发酵时种子液的接种量，分别按照2%、6%、10%、14%、18%的接种量进行试验，以空白培养基作对照，探究最适接种量。每个接种量设3个重复。接种量在2%～18%范围内，菌株均能生长，可说明菌株有较强的耐盐能力。但是接种量为2%时，不利于菌株的发酵；接种量在6%～18%时，随着接种量的变多菌株密度变化不大，可以推测接种量为6%是菌株最佳接种量(图9)。

图9 不同接种量对菌株生长的影响

2.5 菌株在最佳发酵条件下的甘油产量

取发酵液10 mL于小烧杯中加少量蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶中定容。移取上述溶液10 mL于碘量瓶并加入20 mL高碘酸钠溶液，混合均匀后于黑暗中避光静置40 min，再加入20%碘化钾溶液和20%盐酸溶液各15 mL，用硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时，加入2～3 mL淀粉指示剂，继续滴定溶液至蓝色消失且30 s内不再恢复蓝色，同时做试样空白对照。试验测得，菌株发酵液甘油产量为6.003%。

(1)

式(1)中，w—样品中甘油的含量(%)；V1—试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(mL)V2—空白试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积(mL)；C—硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L)；M—甘油相对分子质量。

3 讨论

嗜高温菌在众多的生产工艺中都具有广泛的应用，通过对嗜高温菌的筛选并探究其功能，可为生产生活带来诸多便利。通过在黑松的根系土壤中的筛选，我们获得了一株嗜高温菌，经进一步探究，其可产甘油。通过对其发酵条件进行优化，研究得菌株最佳生长条件：碳源为葡萄糖、50 ℃、盐度为15‰、pH=7、接种量为6%等，同时测得其在最佳发酵条件下甘油产量为6.003%，该产量虽已高于克鲁斯假丝酵母、酿酒酵母等，但与驯化后酵母类真菌发酵相比，处于中等水平[9]。为进一步提高甘油产量，可对该株细菌进行驯化。查阅文献得知，真核微生物即酿酒酵母等对外界渗透压胁迫的应答受高渗甘油应答途径 (HOG途径)的调控[10]，可从菌株的耐高渗透压特性入手，对菌株进行驯化，同时也为细菌的驯化提供了一定的研究方向。可在培养基中适当增加盐的含量，以期完成对该株细菌的驯化，获得更高的甘油产量。