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不同市售品牌咖啡渣中抗氧化成分的提取及活性分析

2023-02-11王寒怡胡炜敏孙杨莹胡奕然

关键词:原儿茶酸市售总酚

王寒怡,胡炜敏,孙杨莹,胡奕然,周 铨,周 婷

(杭州师范大学生命与环境科学学院农产品质量安全控制技术研究杭州市重点实验室, 浙江 杭州 311121)

0 引言

咖啡是世界三大饮料之一,根据国际咖啡组织的统计,2020年全球咖啡消费量超过99亿 kg,是世界上交易量最大的商品之一,它为世界带来巨大经济效益的同时,也给环境造成了极大的负担.科学合理饮用咖啡对人体的健康有益.一些研究发现,咖啡消费量与心脏病和癌症的患病率呈负相关[1],这也是咖啡越来越受消费者喜爱的原因之一.咖啡渣(SCG)是咖啡饮料及速溶咖啡生产过程中的副产物之一,据统计世界范围内SCG年产量达600万 t.此外,我国的咖啡消费市场正处于快速成长期,据产业研究院的报告显示,消费量正以15%的速度飞涨.然而目前国内SCG主要在垃圾填埋厂中处理,尚未被人们利用起来[2].

大部分SCG具有相似的组成成分,即使经过煮制,SCG依旧富含多糖、木质素、蛋白质、脂质和其他高价值化合物,具有转变为各种高价值生物产品的潜力[3].像大多数植物原料一样,SCG组成成分因受很多因素的影响而存在很多差异,比如咖啡豆的自身性质、烘焙工艺[4]等.与许多其他有机废物不同的是,SCG碳氮比、苯酚含量和酸度很高,直接施用到土壤中并不有利于所有植物生长[5],因此需要更加科学经济的处理方式.

SCG中抗氧化成分含量很高,包括酚类化合物、生物碱、黄酮类化合物等,其中酚类化合物是SCG抗氧化性的主要贡献者.近年来从咖啡渣中提取生物活性成分备受关注,提取方法包括传统的固液提取、超临界流体萃取、超声波或微波辅助提取、生物发酵法等,从咖啡渣中提取酚类抗氧化物质最普遍的提取剂为有机溶剂,其中最常用的为醇类[6-8].

最近有研究表明,采用超分子溶剂进行萃取,得到的SCG提取液总酚含量最高,而且此方法操作快速、简便、成本低,并且可以在低液料比下有效提取咖啡渣中的抗氧化活性物质[9].还有一些研究表明,SCG提取之前脱去油脂可以提高酚类物质的产率[10],此外,SCG在提取抗氧化物质之后,还可以用于生产生物乙醇[11],故SCG的综合利用很有研究价值.目前国内对于咖啡渣的研究较少,未有针对市售不同品牌咖啡渣展开研究,通常是采用一种SCG为原料进行抗氧化成分的提取,对提取方法展开讨论研究.

在此背景下,本研究以5种常见市售品牌的SCG为材料,采用超分子溶剂萃取法提取其活性成分,并对SCG提取液的主要抗氧化物质含量及抗氧化能力进行测定,旨在为SCG的综合利用提供一定的理论支持,有助于更好地选择适合提取抗氧化活性物质的原料,为实现分类处理不同来源咖啡渣提供帮助,使SCG的处理方式更科学合理、有针对性.

1 材料与方法

1.1 实验材料

从杭州当地各门店收集5种常见市售品牌的咖啡渣,装入密封袋标记好相应品牌,于-18℃冰箱中冷冻保存以备后续提取.DPPH、TPTZ、绿原酸标准品及主要液体试剂购自国药集团化学试剂有限公司,其他主要固体试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 咖啡渣中抗氧化活性成分的提取

根据文献的提取条件稍加改变[9],用超分子溶剂萃取法提取SCG中的活性成分.提取分为两步:第一步为提取剂的制备,提取剂组成为24%正己醇、30%乙醇和46%超纯水,按上述体积比将正己醇和乙醇混合后加入超纯水静置.第二步是SCG活性成分的萃取,精确称取2.1 g咖啡渣,倒入制备好的6 mL提取剂中,3 000 r/min涡流振荡5 min,6 826 r/min离心20 min,用一次性注射器吸取最上层液体并测量体积,经有机系微孔滤膜过滤后于-18 ℃冷冻保存以待后续测定.

1.3 咖啡渣提取液中抗氧化酚类物质含量测定

1.3.1 不同市售品牌咖啡渣提取液中总酚含量的测定

参考Mussatto等人所使用的福林酚比色法,利用96孔酶标板测定SCG提取液中酚类化合物的总含量,同一样品平行测定3次,实验结果取其平均值[12].准确吸取5 μL 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5 g/L标准溶液或样液、60 μL 7.5%(w/v)的碳酸钠溶液、15 μL福林酚试剂、200 μL蒸馏水至96孔酶标板中,在60 ℃下加热5 min后冷却至室温,在700 nm处测吸光度值.最后以吸光度值为纵坐标,以没食子酸标准溶液的质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,将测得SCG提取液的吸光度值代入没食子酸的标准曲线,得到其酚类化合物的浓度,SCG的总酚含量以没食子酸当量(μg/gwetSCG)表示,计算公式如下:

注:C指SCG提取液中酚类化合物的质量浓度,单位为g/L;V指SCG提取液的总体积,本实验为1.5 mL;m指处理样品的质量,本实验为2.1 g.

1.3.2 不同市售品牌咖啡渣提取液中绿原酸、原儿茶酸含量的测定

采用高效液相色谱-紫外分光光度法进行测定,同一样品连续进样3次,结果取平均值.用流动相配制50、100、250、500、750、1 000 mg/L质量浓度的绿原酸及原儿茶酸的标准溶液,参考Mussatto等人的色谱条件[12],对上述绿原酸及原儿茶酸的标准溶液及SCG提取液进行测定.

色谱条件:紫外检测器波长设置为276 nm,液相色谱柱柱温为室温,流动相由体积比1∶8的乙腈和水、10 g/L的醋酸组成,用磷酸调节流动相的pH至2.5,采取等度洗脱的方式,流速设定为0.9 mL/min,进样量设定为10 μL.

以峰面积为纵坐标,以标准溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线,将样品对应出峰时间下的峰面积代入标准曲线的线性方程,确定SCG提取液的绿原酸及原儿茶酸浓度,SCG中原儿茶酸含量(μg/gwetSCG)及绿原酸含量(μg/gwetSCG)的计算公式如下:

注:式中X指酚酸含量(绿原酸或原儿茶酸),单位为μg/g wet SCG;C指SCG提取液中被测物质的质量浓度,单位为mg/L;V指SCG提取液的总体积,本实验为1.5 mL;m指处理样品的质量,本实验为2.1 g.

1.4 咖啡渣提取液抗氧化活性的测定

1.4.1 不同市售品牌咖啡渣提取液DPPH清除率的测定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀释,准确吸取各组SCG提取液10 μL至96孔酶标板中,然后加入200 μmol/L的DPPH溶液(现配现用)200 μL,空白对照组用甲醇代替SCG提取液,样品对照组用甲醇代替DPPH溶液,每组设置3个平行对照,在室温下黑暗反应30 min后在517 nm处测定其吸光值.按下式计算SCG提取液对DPPH的清除率:

注:式中A1指SCG提取液的吸光值;A2指样品对照组的吸光值;A0指空白对照组的吸光值.

1.4.2 不同市售品牌咖啡渣提取液清除ABTS+能力的测定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀释,准确吸取各组稀释后的SCG提取液或Trolox标准溶液(0、0.40、0.60、0.80、1.0、1.2 mmol/L,溶剂为甲醇)50 μL,加入圆底的离心管中,然后加入1 450 μL ABTS+自由基储存液(现配现用),每组设置3个平行对照,涡流震荡1 min后在室温下黑暗反应30 min,然后在732 nm处测定其吸光值.

以吸光度改变值为纵坐标,以Trolox标准溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线.将样品体系吸光度改变值代入标曲得到提取液中的Trolox当量,按下式计算TEAC值(mmol/gwetSCG):

注:式中TEAC指Trolox当量值,单位为mmol/gwetSCG;CTrolox指SCG提取液相当于Trolox标准液的浓度,单位为mmol/L;V指SCG提取液的总体积,本实验为1.5 mL;m指处理样品的质量,本实验为2.1 g.

1.4.3 不同市售品牌咖啡渣提取液Fe3+还原能力的测定

SCG提取液先用甲醇1∶10稀释,准确吸取150 μLFRAP工作液、15 μL超纯水至96孔酶标板中,室温黑暗下静置5 min后,吸取5 μL各组稀释后的SCG提取液或FeSO4标准溶液(2.0、1.0、0.80、0.50、0.20、0 mol/L),每组设置3个平行对照,室温黑暗下静置30 min后在595 nm处测定其吸光度值.

以吸光度值为纵坐标,以FeSO4溶液的浓度为横坐标,绘制FeSO4标准曲线.将SCG提取液反应后测得的吸光值代入FeSO4标准曲线中,计算出对应的FeSO4浓度后,按下式计算SCG提取液的三价铁还原能力,以FRAP值表征其抗氧化能力.

FRAP(mmol/L)= 10 CFeSO4

1.5 数据统计与分析

用Excel软件作标准曲线及样品各个参数的柱形图,更加直观地对各品牌抗氧化物质含量及抗氧化性进行比较,结果均是3次平行实验的平均值.用SPSS20.0统计软件对数据进行差异性显著分析,数据分析结果中各变量P<0.05表示差异显著,有统计学意义,P<0.01则表示差异达到极显著水平.

2 结果与分析

2.1 不同市售品牌咖啡渣主要抗氧化成分含量的比较

本实验采用的材料是5种市售品牌的SCG,SCG富含抗氧化活性物质,包括酚类化合物、生物碱、黄酮类化合物等,其中酚类化合物是SCG抗氧化性的主要贡献者.绿原酸和原儿茶酸是酚酸,属于酚类化合物,含有多个酚羟基,普遍存在于SCG提取液中,具有良好的抗氧化活性[9].故本实验选择对SCG中的总酚、绿原酸和原儿茶酸通过外标法进行定量分析,实验结果如下所述.

2.1.1 总酚含量结果分析

除了L品牌与S品牌、L品牌与T品牌无显著差异外,其余品牌之间总酚含量的差异都比较显著(P<0.05).T品牌、L品牌、S品牌的SCG中总酚含量相当,均在600 μg/gwetSCG附近,明显高于K品牌与M品牌,K品牌与M品牌的SCG中总酚含量分别为439、398μg/gwetSCG,约为T品牌、L品牌、S品牌的三分之二(图1).

图1 不同市售品牌咖啡渣的总酚含量Fig.1 The TPC in SCG of different commercially available brands

2 不同市售品牌咖啡渣的绿原酸含量Fig.2 The content of 3-CQA in SCG of different commercially available brands

2.1.2 绿原酸含量结果分析

M品牌与L品牌的绿原酸含量相近,两者差异性不显著,其余各品牌的绿原酸含量差异均达极显著水平(P< 0.01).T品牌SCG的绿原酸含量远高于其他几个品牌,剩下4个品牌SCG中绿原酸含量由高到低依次为K品牌、M品牌、L品牌、S品牌、T品牌的绿原酸含量为其余4个品牌的2~18倍,为K品牌的2.8倍,S品牌的18倍多(图2).

2.1.3 原儿茶酸含量结果分析

各品牌SCG的原儿茶酸含量差异均极为显著(P< 0.01).L品牌、S品牌、T品牌SCG中原儿茶酸含量在80μg/gwetSCG附近,远高于M品牌与K品牌,约为M品牌的4倍,K品牌的2倍(图3).

图3 不同市售品牌咖啡渣的原儿茶酸含量Fig.3 The content of PCA in SCG of different commercially available brands

图4 不同市售品牌咖啡渣提取液的DPPH清除率Fig.4 The DPPH radical scavenging capacity of SCG extracts of different commercially available brands

结合图2、3的数据,可以发现,原儿茶酸含量接近绿原酸含量的10倍,所以绿原酸的含量相对原儿茶酸来说较小.此外,结合图1、图2数据对总酚含量及原儿茶酸含量进行比较,可以得出结论:原儿茶酸占总酚含量的16% 左右,还含有其他酚类物质.本实验色谱条件下,绿原酸在13 min出峰,原儿茶酸在8 min出峰,两者皆峰形好、保留时间适中,并且通过观察各品牌SCG提取液的色谱图可以发现它们峰的种类及数量均有不同,由此可以得出各品牌SCG的活性物质组成差异较大,这可能与各品牌所用咖啡豆的品种、产地、收获后的加工工艺不同有关.

2.2 不同市售品牌咖啡渣提取液抗氧化能力的比较

评价植物提取物的抗氧化活性的方法有很多,本实验用体外总的抗氧化能力评价SCG提取液的抗氧化活性,依据抗氧化物质具有捕获自由基及还原氧化态物质的原理进行SCG提取液抗氧化活性的测定分析.具体采用的方法是DPPH自由基清除法(DPPH法)、ABTS自由基清除法(ABTS法)、铁离子还原法(FRAP法),这3种方法较为广泛地应用于天然提取物的抗氧化能力测定,并且多种方法结合可以较为全面分析一种物质的抗氧化能力,实验结果如下所述.

2.2.1 DPPH清除率结果分析

各品牌SCG提取液DPPH清除率差异显著(P<0.05),除了T品牌与S品牌,其余各品牌之间的差异均达极显著水平(P<0.01).S品牌、T品牌和L品牌的SCG提取液DPPH清除率大于40%,其中清除率最高的是S品牌,清除率约为K品牌的2.5倍,M品牌的SCG提取液DPPH清除率略高于K品牌,但与其余3种相差较大,S品牌、T品牌和L品牌的SCG提取液抗氧化能力明显强于M品牌和K品牌(图4).

2.2.2 ABTS+捕获能力结果分析

5种市售品牌SCG的Trolox当量介于7~8mmol/gwetSCG之间,均表现出较好的抗氧化活性[13],但各品牌SCG提取液的ABTS+捕获能力仍差异显著(P<0.05),由高到低为L品牌、S品牌、T品牌、K品牌、M品牌(图5).

图5 不同市售品牌咖啡渣提取液捕获ABTS+能力Fig.5 The ABTS+ radical scavenging capacity of SCG extracts of different commercially available brands

图6 不同市售品牌咖啡渣提取液FRAP值Fig.6 The Fe3+ reducing capacity of SCG extracts of different commercially available brands

2.2.3 Fe3+还原能力结果分析

T品牌和S品牌的FRAP值相近,两者的Fe3+还原能力差异不显著,其余各品牌SCG提取液Fe3+还原能力差异显著(P<0.05),各品牌SCG提取液的Fe3+还原能力由高到低为S品牌、T品牌、L品牌、M品牌、K品牌(图6).

总的来看,T品牌、M品牌、K品牌、S品牌、L品牌这5个品牌SCG的DPPH清除率与FRAP值趋势一致,结论是S品牌>T品牌>L品牌>M品牌>K品牌,其中S品牌与T品牌的差异并不明显,故S品牌SCG中可清除DPPH自由基、还原Fe3+的活性成分含量与T品牌的咖啡渣活性成分含量相当,并列第一,L品牌咖啡渣有效成分含量次之,M品牌SCG的活性成分含量排名第四,而K品牌中活性成分的含量最少.此外,各品牌咖啡渣TEAC值的高低顺序与以上两者稍有不同,L品牌最高,其余顺序保持不变,不过从其数值上分析可捕获ABTS+能力的活性成分含量均比较可观.

2.3 SCG提取液的抗氧化能力与抗氧化物质含量的相关性分析

通过对5种市售品牌咖啡渣主要抗氧化活性成分酚类物质含量与其提取液的抗氧化能力的统计分析可知,SCG总酚含量因其品牌不同而有很大差异,不同市售品牌SCG的抗氧化活性存在差异,其中T品牌、S品牌及L品牌的SCG提取液抗氧化能力优于M品牌和K品牌.S品牌、T品牌、L品牌的SCG总酚含量也较高,使用它们作为原料,采用相同的提取方法所获得的SCG提取液抗氧化活性较高,说明SCG提取液抗氧化活性与SCG总酚含量有一定的相关性,这与药食两用植物的抗氧化活性及其与总酚的相关性分析及浆果类多酚类物质与抗氧化活性的研究结果相符合[14-15].用SPSS进行相关性分析的结果为显著相关.

3 总结与讨论

采用醇类为提取剂提取并测定植物原料中的抗氧化物质,SCG的总酚含量可达20~30 mg/gdry SCG,与其他重要的抗氧化物质原料的总酚含量进行比较,如成熟树莓(12.0~15.3 mg/g干物质)、黑莓(12.1~14.8 mg/g干物质)[16]和杏仁壳(22.0 mg/g干物质)[17],可以发现SCG的总酚含量较高.将在本实验提取条件下得出的实验结果与上述报道值比较,显然,此提取方法的提取率还不够高,这主要是因为实验采用的原料是湿基SCG.但此提取方法的液料比低、操作简便、提取时间短,故其时间及经济成本低且此法提取得到的SCG提取液活性成分的质量浓度是其他常见方法的2~3倍,高达0.9 mg/mL.

另外,通过比较各品牌SCG中绿原酸及原儿茶酸含量,观察其数值大小,并结合SCG提取液的抗氧化能力进行分析可得,其绿原酸含量与抗氧化能力变化趋势不一致,推断出绿原酸不是SCG中抗氧化活性的主要贡献者.原因可能是咖啡豆中的绿原酸在烘焙过程中发生裂解损失掉大部分,且在煮制过程中被萃取到咖啡中,最终SCG中绿原酸含量较其他抗氧化物质低.不过本实验未对SCG中其他酚类抗氧化物质进行研究,若要明确SCG中各酚类单体与其抗氧化活性的关系及其对总抗氧化能力的贡献率,还要进行深入研究.

Abbasi-Parizad等人采用HPLC、HPLC-DAD和LC-ES-MS对葡萄渣、咖啡渣、番茄渣和红玉米芯4种农产品加工废弃物的乙醇提取物中的酚酸、黄酮类化合物和花青素进行了完整的表征, 并且围绕其清除DPPH自由基的能力和抗炎能力展开了研究,结合各副产品的相关信息,得出咖啡渣的再利用最适宜进行开发达到工业化水平.该研究还对SCG中的酚类物质进行了进一步表征,其实验结果为芹菜素、表儿茶素、山奈酚和柚皮苷查尔酮是清除DPPH的主要成分[18].故采用咖啡渣再利用工业化具有一定的可行性,且上述明确贡献率的深入研究已存在供参考的方法.

最后若要在这5种市售品牌SCG中选择抗氧化酚类物质的提取原料,推荐选择S品牌、T品牌、L品牌.考虑到本实验提取方法提取率及反应体系较小的局限性,只适用于实验室进行前期工作的初步研究,后续研究工作需要对此法进行优化并扩大反应体系后与其他方法结合,使其适用于工厂实际生产,实现食品加工废弃物SCG的资源化.

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