张小云，李前辉，林涛，潘胜男，刘万波，唐朝贵

MALDI-TOF MS在血流感染快速鉴定病原菌中的应用

张小云，李前辉，林涛，潘胜男，刘万波，唐朝贵

南京医科大学附属淮安第一医院检验科，江苏淮安 223300

探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）结合短时培养在快速鉴定血流感染病原菌中的应用。对南京医科大学附属淮安第一医院微生物室2020年11月至2021年12月血培养报告阳性的标本进行革兰染色分类，并采用4h和6h短时培养法及MALDI-TOF MS技术快速鉴定感染病原菌并实时报送病区单元。4h短时培养革兰阴性菌共351株，339株（96.6%）细菌鉴定到种属，与24h鉴定结果相同，11株无鉴定结果，1株鉴定错误；6h短时培养革兰阳性菌共216株，212株（98.1%）鉴定到种属，与24h鉴定结果相同，3株无鉴定结果，1株鉴定错误。跟踪321株革兰阴性菌的临床反馈，287例（89.4%）给予临床关注，89例（27.7%）进行药物调整，238例（74.1%）临床疗效良好；跟踪183株革兰阳性菌的临床反馈，其中150例（82.0%）给予临床关注，49例（26.8%）进行药物调整，131例（71.6%）临床疗效良好。MALDI-TOF MS技术结合短时培养方法可有效提高血流感染病原菌鉴定准确率，改善血流感染患者抗菌药物治疗时机。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；短时培养；快速鉴定；血流感染

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix- assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术近年来逐步应用于病原微生物的鉴定中，特别是在血流感染质谱快速鉴定病原菌方面的研究和探讨尤其热烈。短时培养法鉴定流程中分离胶[1-2]及短时固相培养法[3-4]因其具备一定的适用性、高效性备受实验室关注，笔者根据相关专家共识及文献报道[5-6]结合临床微生物实验室实际工作可操作性和质谱鉴定高效性，采用短时固相培养法并进行改进，对南京医科大学附属淮安第一医院2020年11月至2021年12月临床血流感染患者阳性血培养瓶进行短时固相培养质谱快速鉴定，并向临床发布质谱鉴定结果，比较短时培养质谱快速鉴定与常规方法的一致性，并跟踪分析质谱鉴定结果对患者临床疗效的影响，为建立血培养阳性标本质谱快速鉴定方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集南京医科大学附属淮安第一医院检验科微生物室2020年11月至2021年12月血培养报告阳性标本，剔除同一人多套重复菌株及两种以上菌混合感染的标本，共培养菌株567株。

1.2 仪器与试剂

Bactec FX全自动血培养仪和血培养瓶（美国BD公司）；MALDI-TOF MS质谱仪和基质液及甲酸（法国生物梅里埃有限公司），血平板、巧克力平板培养基（郑州安图生物工程股份有限公司）；细菌培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.3 检测方法

血培养报告阳性立即进行革兰染色并转种培养皿35℃、5%CO2恒温孵箱孵育培养，革兰阴性菌培养4h、革兰阳性菌培养6h后进行质谱鉴定（无鉴定结果菌株排除非待测菌株本身原因）。混合细菌及真菌待肉眼可见菌落后鉴定，给予剔除，不计入最后统计结果。结束后平板放回孵育箱继续培养，次日上午再次对24h单个菌落进行质谱鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC8739及产气肠杆菌ATCC13048。

1.4 血培养阳性标本常规鉴定

当血培养提示阳性时，取出阳性瓶进行革兰染色并转种至相应的平板37℃温育18～24h，平板分离出的单个菌落直接涂布于靶板上，滴加1μl的基质液干燥后进行鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC8739及产气肠杆菌ATCC13048。

2 结果

2.1 革兰阴性菌4h短时培养结果质谱鉴定

351株革兰阴性菌中共有339株（96.6%）细菌鉴定到种属，与24h鉴定结果相同。11株无鉴定结果，分别为肺炎克雷伯菌2株，铜绿假单胞菌2株、缺陷短波单胞菌1株、嗜水气单胞菌1株、荧光假单胞菌1株、放射形土壤杆菌1株、布氏杆菌1株、脆弱拟杆菌1株、阴道加德拉菌1株。1株鉴定错误菌株为铜绿假单胞菌，见表1。

表1 革兰阴性菌4h与24h培养质谱鉴定结果[n（%）]

2.2 革兰阳性菌6h短时培养质谱鉴定结果

216株革兰阳性菌共有212株（98.1%）鉴定到种属，与24h鉴定结果相同，3株无鉴定结果，经24h培养，鉴定结果分别为缓症链球菌1株，肺炎链球菌1株，血液链球菌1株。1株鉴定错误菌株为马红球菌，见表2。

2.3 质谱鉴定结果实验室信息系统发布临床反馈

跟踪321株质谱初步鉴定为革兰阴性菌患者，其中287例（89.4%）给予临床关注，89例（27.7%）进行药物调整，238例（74.1%）临床疗效良好。跟踪183株质谱初步鉴定为革兰阳性菌患者，其中150例（82.0%）给予临床关注，49例（26.8%）进行药物调整，131例（71.6%）临床疗效良好，见表3。

3 讨论

与传统的表型技术或分子生物学相比，MALDI- TOF MS病原微生物鉴定技术是一种功能强大、快速、精确且经济高效的鉴定完整细菌的方法[3]。在常规工作流程中，可将微生物鉴定的时间缩短约24h，有利于临床应用抗菌药物治疗[7-8]。及时的病原学诊断对于临床感染性疾病患者，尤其是血流感染和重症感染患者的临床决策、控制感染进程、挽救患者生命至关重要，不仅可显著提高患者存活率，还可大大降低医疗费用[9-11]。

目前，血流感染质谱快速鉴定病原菌前处理方法主要有：去污剂选择裂解法、渗透压选择裂解法、分离胶分离法、滤膜过滤分离法[12-14]，然而因其操作烦琐及需要提取试剂盒等原因，现临床微生物室多采用短时培养法进行微生物病原菌的鉴定，随着培养时间的延长其鉴定成功率随之增加[2,15-16]，为进一步顺应该技术可操作性，提升鉴定成功率，本研究改进流程及操作，使8点至14点报告阳性的血培养标本当日均能得到鉴定结果。

表2 革兰阳性菌6h与24h培养质谱鉴定结果[n（%）]

表3 504例质谱鉴定菌株结果发布后临床响应情况[n（%）]

注：临床关注：临床收到质谱鉴定结果后临床病程有记录，医生查房有交代；药物调整：临床收到质谱鉴定结果后根据具体细菌调整相应抗菌药物，与之前经验用药有不同

351株革兰阴性菌经4h短时培养，共有339株（96.6%）细菌鉴定到种属，与24h鉴定结果相同，与既往文献报道相近[12,17]，11株无鉴定结果。其中肠杆菌科2株均为肺炎克雷伯菌，气单胞菌属1株为嗜水气单胞菌，非发酵菌属2株为铜绿假单胞菌和缺陷短波单胞菌，观察其24h菌落形态生长情况，分析原因可能与生长较缓慢及菌落色素沉积、肥大、水样多黏性等因素不能获取足够的蛋白相关[18]；放射形土壤杆菌1株，是否因菌株原因或菌株库局限原因有待考证，目前文献报道尚少；布氏杆菌1株推测与其接种量低，生长缓慢及生物标本库不足有关[19]。鉴定错误的1株铜绿假单胞菌推测测试失败的主要原因是缺乏可测量的质量信号[20]。216株革兰阳性菌经6h短时培养共有212株（98.1%）鉴定到种属，与24h鉴定结果相同，与余德基等[17]报道相近，高于潘宏伟等[12]报道结果，推测原因可能与菌株不同有关。3株无鉴定结果菌株经24h培养，鉴定结果分别为血液链球1株，缓症链球菌1株，肺炎链球菌1株，推测原因可能与菌株生长缓慢、培养瓶报警时含菌量低及细胞壁较坚韧、不易裂解等原因，1株马红球菌鉴定错误，与24h第2次鉴定结果不同且结果错误，后经科研库鉴定为马红球菌，因此质谱鉴定目前对罕见菌和菌株的少见型检测存在不足，测试失败的主要原因是缺乏可测量的质量信号及生物标本库不足原因[19-20]。183株革兰阳性菌主要为葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属，临床关注度为82.0%，略低于革兰阴性菌（89.4%），最低为木糖葡萄球菌（60.0%），推测与该菌株致病力弱及非临床感染有关，后续将进一步跟踪调查。

血流感染是住院患者死亡的主要原因。由于抗菌治疗的延迟与患者不良反应的增加密切相关，因此快速诊断至关重要[8]。504株菌经质谱鉴定后立即按血流感染危急值通过实验室信息系统发布临床，医生通过医院信息系统工作站可实时接收和查询报告结果，病程记录和上级医生查房显示，革兰阴性菌临床关注为89.4%，其中鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等100%获得临床及时关注并进行查房讨论，关注略低的大肠埃希菌和产酸克雷伯菌，分别为75.0%和85.0%，可能与其多为非多重耐药菌有关。而药物调整仅为27.7%，分析原因可能与临床经验抗感染药物覆盖了该菌株的耐药谱，最终74.1%的患者取得良好的临床疗效。革兰阳性菌药物调整为26.8%，与革兰阴性菌相似，临床疗效良好占比71.6%。本研究发现短时固相培养鉴定方法可快速鉴定出细菌种类，及时指导临床有针对性使用抗生素，能有效改善患者预后。

综上所述，MALDI-TOF MS技术结合短时固相培养方法可有效提高血流感染病原菌鉴定准确率，且简便易行，有效改善血流感染患者抗菌药物治疗时机。

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Application of MALDI-TOF MS in rapid identification of pathogenic bacteria of bloodstream infection

Clinical Laboratory, the Affiliated Huaian No.1 People’s Hospital of Nanjing Medical University, Huaian 223300, Jiangsu, China

To investigate the clinical diagnostic value of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) combined with short-time culture in rapid identification of pathogenic bacteria of bloodstream infection.From November 2020 to December 2021, the positive blood culture samples in the Microbiology Room of the Affiliated Huaian No.1 People’s Hospital of Nanjing Medical University were classified by Gram staining, and the pathogenic bacteria were rapidly identified by 4h and 6h short-time culture method and MALDI-TOF MS technique and reported to the ward unit in real time.There were 351 strains of Gram-negative bacteria in 4h culture, 339 (96.6%) strains were identified to the species level, which was the same as 24h identification, 11 strains were not identified and 1 strain were identified incorrectly. A total of 216 Gram-positive strains were cultured at 6h, 212 (98.1%) strains were identified to the species level, which was the same with 24h identification, 3 strains were not identified and 1 strain were identified incorrectly. Clinical feedback of 321 strains of Gram-negative bacteria were followed, 287 (89.4%) cases received clinical attention, 89 (27.7%) cases received drug adjustment, 238 (74.1%) cases received good clinical effect. Clinical feedback of 183 strains of Gram-positive bacteria were followed, 150 (82.0%) cases received clinical attention, 49 (26.8%) cases received drug adjustment, 131 (71.6%) cases had good clinical effect.MALDI-TOF MS technology combined with short-time culture method can effectively improve the identification accuracy of pathogenic bacteria of bloodstream infection, which is effectively improving the timing of antimicrobial treatment for patients with bloodstream infection.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; Short-term culture; Rapid identification; Bloodstream infection

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.01.019

唐朝贵，电子信箱：hayytcg@163.com

（2022–07–14）

（2022–12–26）